Normal
0
7.8 磅
0
2
false
false
false
EN-US
ZH-CN
X-NONE
/* Style Definitions */
table.MsoNormalTable
{mso-style-name:普通表格;
mso-tstyle-rowband-size:0;
mso-tstyle-colband-size:0;
mso-style-noshow:yes;
mso-style-priority:99;
mso-style-parent:"";
mso-padding-alt:0cm 5.4pt 0cm 5.4pt;
mso-para-margin:0cm;
mso-para-margin-bottom:.0001pt;
mso-pagination:widow-orphan;
font-size:10.5pt;
mso-bidi-font-size:11.0pt;
font-family:"Calibri","sans-serif";
mso-ascii-font-family:Calibri;
mso-ascii-theme-font:minor-latin;
mso-hansi-font-family:Calibri;
mso-hansi-theme-font:minor-latin;
mso-bidi-font-family:"Times New Roman";
mso-bidi-theme-font:minor-bidi;
mso-font-kerning:1.0pt;}
大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。
分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA 克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA 序列具有异乎寻常的多样性（因而它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质（因而它具有执行众多生物学功能的用途）。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化，但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier 等发展的以噬菌体T7RNA 聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达（over-expression），表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%。
一、可溶性产物的纯化
（一）试剂准备
采用T7· Tag Affinity Purification Kit
1、T7·Tag 抗体琼脂
（二）操作步骤
1、100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml 预冷的B/W 缓冲液重悬。
2、重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。
3、将结合T7·Tag 抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。
4、B/W 缓冲液平衡后样品液过柱。
5、10ml B/W 缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。
6、用5ml 洗脱缓冲液过柱，每次1ml，洗脱液用含150μl 中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE 分析。
7、将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr，中间换液数次。
8、用PEG 20000 浓缩蛋白。
（三）注意事项
蛋白在过层析柱前，要0.45μm 膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。
二、包涵体的纯化
包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH 值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态
大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。
分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA 克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA 序列具有异乎寻常的多样性（因而它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质（因而它具有执行众多生物学功能的用途）。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化，但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier 等发展的以噬菌体T7RNA 聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达（over-expression），表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%。
一、可溶性产物的纯化
（一）试剂准备
采用T7· Tag Affinity Purification Kit
1、T7·Tag 抗体琼脂
（二）操作步骤
1、100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml 预冷的B/W 缓冲液重悬。
2、重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。
3、将结合T7·Tag 抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。
4、B/W 缓冲液平衡后样品液过柱。
5、10ml B/W 缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。
6、用5ml 洗脱缓冲液过柱，每次1ml，洗脱液用含150μl 中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE 分析。
7、将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr，中间换液数次。
8、用PEG 20000 浓缩蛋白。
（三）注意事项
蛋白在过层析柱前，要0.45μm 膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。
二、包涵体的纯化
包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH 值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态
