（1）小鼠品系
目前已经有很多个小鼠品系建立了胚胎干细胞系，但最容易建立ES细胞系且建立的ES细胞系从整体嵌合率和生殖系嵌合能力最高的品系还数129品系。最早建立的小鼠胚胎干细胞系就是由远交系小鼠129品系的胚胎分离得到的。早在1954年，人们就发现，约有1%的129品系小鼠会自发在睾丸中产生畸胎瘤（一般为恶性肿瘤，组织分析显示包含胚胎和含有代表三胚层的成体组织类型，后证实是由睾丸中的多能性细胞增殖分化得到的）。
1960年，人们发现这种畸胎瘤经体外分离培养可建立一种可无限增殖的细胞系，命名为胚胎癌细胞系Embryonal Carcinoma Cells（ECCs）。通过移植实验证明，单个EC细胞移植即可在受体内形成具有三胚层组织类型的畸胎瘤。说明建立的EC细胞具有多能性和自我更新的能力。


129品系的畸胎瘤高发性从某种角度可说明这一品系的多能性细胞具有相对较强的增殖分化能力，后来的研究也证明了129品系小鼠确实具备其他品系的小鼠缺乏的ES细胞高建系率和高生殖系嵌合率。相对的，近交系C57BL/6小鼠分离培养小鼠胚胎干细胞系的难度很大，近交系BALB/c小鼠建系率则更低，且对于血清、饲养层的批次，培养液PH等培养条件更敏感。另外在嵌合体的进系效率上这两个物种相比于129品系也更低。从整体上，远交系小鼠的建系效率与嵌合率确实高于近交系小鼠，当然究其本质，还是不同品系建立的细胞系基因表达模式和表观遗传学模式的不同决定的。
Rudolf Jaenisch等发现在进行最严格的嵌合——四倍体补偿实验与核移植实验中均发现，作为细胞供体，杂交F1代细胞要比纯近交系细胞更利于获得成体鼠。说明供体细胞的杂合性对于后续发育的重要性，甚至129×C57BL/6干细胞来源的成体活鼠要多于纯129干细胞来源的成体活鼠。

同样，受体囊胚的杂合性也表现出了对于成体鼠成活率的优势。哺乳动物的发育再次向我们证明了杂种优势。
见
The genetic heterozygosity and fitness of tetraploid embryos and embryonic stem cells are crucial parameters influencing survival of mice derived from embryonic stem cells by tetraploid embryo aggregation.pdf
当研究功能基因组学时，基因打靶是必要的技术手段。基因打靶需要依赖显微操作构建嵌合体，并且要求小鼠遗传背景清晰，因此，胚胎干细胞及受体囊胚的品系来源都有所限制。对于基因打靶来说，C57BL/6品系是目前最适合的干细胞来源。
目前常见的用于构建嵌合体胚胎干细胞品系与受体囊胚的品系搭配如下图所示：



在细胞供体与受体囊胚的品系搭配上，也能看出，除了毛色差异的要求之外，品系的选择还应考虑到细胞供体与受体囊胚的竞争性，应使细胞供体处于竞争优势，才能获得更高的生殖系嵌合率。

(2)胚胎干细胞系的多能性状态
胚胎干细胞之所以能够注射入囊胚中后参与胚胎重建，是因为胚胎干细胞的多能性状态与囊胚中的内细胞团多能性状态一致，注射后才可以与胚胎同步发育。如果胚胎干细胞在注射以前就出现了分化，那么此时细胞连接等就会与胚胎不同，而无法与胚胎有效结合，更无法与胚胎同步发育，此时就会被囊胚内细胞团竞争排斥，甚至使胚胎致死。
胚胎干细胞的多能性状态对于嵌合体的成活率及嵌合率都至关重要。 体外的培养条件虽然模拟却无法比拟体内环境，胚胎干细胞在不适宜的培养条件下会导致分化，如何去维持胚胎干细胞的多能性状态主要依赖于培养细胞的操作。
楼上已述，近交系如C57BL/6 胚胎干细胞相对129对培养环境较为敏感，相比于129品系更容易失去生殖系嵌合能力。因此培养B6 ES细胞系时，对培养液成分、饲养层质量、接种密度、传代比等都需要严格要求。小鼠胚胎干细胞培养操作规范已很完善，具体操作在此不详述。

对于小鼠胚胎干细胞的培养液成分的优化最近几年有较大进展，值得探索研究。
2003年，DÉSIRÉ COLLEN发表文章证明利用转染了兔LIF的兔成纤维细胞系得到的条件培养液，可培养分离多个近交系小鼠品系的胚胎干细胞，包括当时被认为无法建立胚胎干细胞系的小鼠品系，如C57BL/6N, C57BL/6JOla,CBA/CaOla, DBA/2N, DBA/1Ola, C3H/HeN, BALB/c等，并且这些细胞系能够通过囊胚注射和四倍体补偿检测产生嵌合体。
见
improved generation of germline competent embryonic stem cell lines from inbred mouse strains
2009年，Yoshitaka Tamai等人证明在基础培养液中加入LIF和GSK3的抑制子BIO(6-bromoindirubin-3'-oxime) 可以在无饲养层且无血清的条件下维持小鼠胚胎干细胞的多能性及自我更新，并且获得的小鼠ES细胞系具有生殖系嵌合能力。
见
Stable generation of serum- and feeder-free embryonic stem cell-derived mice with full germline-competency by using a GSK3 specific inhibitor
同年，Rudolf Jaenisch等发现原来被认为无法建立胚胎干细胞系的非肥胖型糖尿病模型NOD小鼠，也能够通过添加小分子物质信号抑制子建立具有生殖系嵌合能力的胚胎干细胞系。
见
Metastable Pluripotent States in NOD-Mouse-Derived ESCs
这些研究结果证明改善培养条件有助于提高生殖系嵌合率。
另外，近年来有一些文章证明嵌合率较高的胚胎干细胞或iPS细胞中高表达某些基因，或许可以通过检测基因表达来选择更好的克隆用于显微注射。 如tbx3等。

（3）细胞培养中积累的染色体异常
体外培养的细胞经常出现缺失、倒位、易位等染色质异常现象，对于分裂速度较快的干细胞来说更容易产生这种现象。胚胎干细胞可以在核型异常的条件下维持细胞的多能型（例如胚胎癌细胞，ECCs），因此如不进行核型分析，在培养条件下是无法区分胚胎干细胞的核型正常或异常。目前的研究证明，核型的不稳定性是导致胚胎干细胞生殖系嵌合率低的主要原因之一。
早在1997年，Letizia Longo等人就发现，随着细胞传代次数的增加，核型异常的细胞比例逐渐增大，当核型异常的细胞比例增至50%以上，他们所检测的胚胎细胞系都失去了生殖系嵌合能力，同时其他组织贡献率也相应降低，虽然也可获得贡献率相对较高的嵌合体，但这种嵌合体通常无法正常发育而致死。如表所示：



因此，在进行显微注射之前，核型分析检测细胞核型是否正常是重要的步骤，目前主要的核型分析方法主要有以下几种：
1.传统方法——GRQ带技术

2.主流方法——荧光原位杂交技术

3　发展趋势——光谱核型分析技术



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