500年来，人们一直对《蒙娜丽莎》神秘的微笑莫衷一是。不同的观者或在不同的时间去看，感受似乎都不同。有时觉得她笑得舒畅温柔，有时又显得严肃，有时像是略含哀伤，有时甚至显出讥嘲和揶揄。在一幅画中，光线的变化不能像在雕塑中产生那样大的差别。但在蒙娜丽莎的脸上，微暗的阴影时隐时现，为她的双眼与唇部披上了一层面纱。而人的笑容主要表现在眼角和嘴角上，达·芬奇却偏把这些部位画得若隐若现，没有明确的界线，因此才会有这令人捉摸不定的“神秘的微笑”。
哈佛大学神经科专家利文斯通博士说，蒙娜丽莎的微笑时隐时现，是与人体视觉系统有关，而不是因为画中人表情神秘莫测。利文斯通说：“如果看着她的嘴巴，使得我们永远无法捕捉她的笑容。”蒙娜丽莎的笑容若隐若现，源于人们的目光不断转移。从整幅画的画面来看，无论是主体蒙娜丽莎女士，还是背景的山水田园风光。无不默默的用其具象化的形态阐释着抽象化的意象。事实上，审美欣赏更受到审美经验的制约。每个人都处于自己特定的时代氛围，具有自己的文化历史传统和独特的境况，所以每个人对艺术本体的理解都会打上自己的个性和存在的烙印。在文艺复兴时代，艺术家们崇尚人的精神，无论从绘画、雕刻还是音乐、戏剧，其内容逐渐的脱离了神的范畴。就连拉斐尔的圣母像也已人间的母亲为蓝本。在这个推崇人类至上而宗教法度严酷的时代，公然在作品中以人为主角，无疑是一大进步。于是蒙娜丽莎就被赋予了更深层次的思想内涵。即在审美欣赏主体参加理解和体验活动时，不能单纯的去停留在欣赏的表面，必然得带有一定的主观性，这种主观性是对艺术作品加以理解的不可缺少的"前结构"。也正因为这种"前结构"中蕴含的主观性，而使审美主体进行了创造性的理解，或者说对美产生了不同的理解。具体到《蒙娜丽莎》这幅画作来说，就是：蒙娜丽莎安详而又自信的神态，代表了人的一种生存和向上的精神风貌。其身后的田园风光则昭示着人间的无限美好恬静。仅此两方面的具象表达，则足以体现了画家想表现的抽象意识了。而最为具体深入，那就只有达芬奇自己清楚了。