整幅画的主题是耶稣正在宣布他的使徒中有一个人出卖了他，听到这里，餐桌前所有的使徒都表现出不同的反应。
根据画在卢加诺特的一张复本上的题字，画中人物自左向右分别是：
巴塞洛缪、小詹姆斯、安德鲁、犹大、彼德、约翰、耶稣、托马斯、大詹姆斯、菲利普、马休、撒迪厄斯、西蒙。

画面上有一只无主的手，拿着一把刀，就在彼得的旁边，其实，这只手不属于画面上任何一个人。那么，请设想一下，达芬奇把门徒约翰用其他人的身体挡住了，但是，他又故意露出一只拿刀的手来暗示人们，这只手的主人才是门徒约翰！！！

所以，这幅画中实际上一共有14个人！

再来看看托马斯，他坐在耶稣的右边，他“举起食指”作出一个威胁的姿势，这个手势是施洗者约翰经常用的招牌手势，据说这个手势代表秘密的知识与智慧。艺术史学家认为施洗者约翰比耶稣起到了更重要的作用，而不是完全像《圣经》里描述的那样。想了解详细地说明的人，可以读一下《圣殿骑士启示录》。

托马斯向上“伸出食指”，是因为他听到耶稣宣布和这名女子（抹大拉的的玛利亚）的婚姻时，警告他不要这么做。

再来看看耶稣右边穿绿衣服的大詹姆斯，他的眼睛看向玛利亚，并且伸出一只手臂给玛利亚留出了空间。

再看看左数第五位彼得，面目凶狠，他的左手好像要砍向玛利亚的脖颈，一幅威胁的姿势，他的意图是要阻止这个女人玛利亚，因为他认为玛利亚会毁了耶稣的“神性”。
教会为了神化耶稣，千方百计地想抹杀关于这个女人的一切，但是达芬奇却在他的巨作中向我们阐述了这个秘密！

最左边的两位是巴塞洛缪和小詹姆斯，他们发现彼得想杀玛利亚后，小詹姆斯伸出一只手搭在彼得的肩上，意图阻止彼得。

左边第三位是安德鲁，他吓得在胸前张开双手，不知如何是好。

左边第四位是犹大，他一手握钱袋子，另一只手在桌上伸出来，也是意图阻止彼得想杀害玛利亚。

那么，那只拿刀的手的主人约翰，坐在什么位置最合适呢？下面这个红色的人坐的位置，大家看看，把他和拿刀的手连接起来，正好就吻合了。
也就是说，玛利亚坐的的位置实际上就是约翰坐的位置，这一个位置是由两个人共同坐的，因为约翰和玛利亚是双生灵魂，一男一女，他俩其实是同一个人！
约翰拿刀的手，在彼得身前伸出来，实际上要警告彼得，不允许他杀害玛利亚！

《施洗者约翰》

施洗者约翰神秘的手势，诡异的笑容，达芬奇在这幅画里到底暗示了什么？其实，约翰的手臂构成的图形也是“斐波那契螺旋”，[url]http://黄金比例[/url]是一个重要的核心[url]http://美学概念[/url]，PHI= 0.618 (分子/分母)或者 1.618(分母/分子)。
意大利著名数学家“斐波那契”以他的名字命名的 1,1,2,3,5,8,13,21......
上帝的法则，自然的法则。
达芬奇是卓越的科学家，观察自然界的高手，他要用施洗的约翰告诉世人，瞧，这就是God！

我们如果把施洗者约翰和蒙娜丽莎对比一下，会发现两张脸长得很像，实际上，他们就是一个人！
圣经中记载的施洗者约翰，是一个瘦子，且为男性，但达芬奇却把他画的那么饱满，同时具有男性和女性的特征，似乎在对你笑着说：“猜猜我是男？还是女？”
约翰左手摸着自己的心脏，右手指向十字架，这是暗示我们，他要说的是：“上帝在我心中，我的心与上帝同在！”