摘要：为探讨犬皮肤及软组织组织中环氧合酶-2（COX-2）蛋白的表达与皮肤及软组织肿瘤的发生关系，我们首先对临床上收集到的12例犬皮肤及软组织肿瘤进行了组织病理学分类，然后采用免疫组化方法检测了12例皮肤及软组织肿瘤组织及6例正常皮肤组织中COX-2的表达情况。结果显示：12例犬皮肤及软组织肿瘤中良性肿瘤9例，占75%；恶性肿瘤3例，占25%。在9例良性肿瘤中基底细胞瘤1例，纤维瘤1例，血管周细胞瘤1例，皮脂腺瘤2例，皮脂腺上皮瘤2例，毛母细胞瘤2例；在3例恶性肿瘤中皮脂腺癌2例，脂肪肉瘤1例。COX-2在犬皮肤及软组织肿瘤中的阳性表达主要位于肿瘤细胞的胞浆内及胞核周围，为棕黄色颗粒，12例皮肤及软组织肿瘤中7例COX-2呈强阳性表达，阳性表达率为58.3%（7/12），正常皮肤中COX-2均无表达。因此，COX-2在犬皮肤及软组织肿瘤中的表达可作为犬皮肤及软组织肿瘤诊断的依据之一。
关键词：犬；皮肤及软组织；肿瘤；病理组织；免疫组化；环氧合酶-2
随着我国宠物犬的养殖数量不断增加，各种犬病的发生率也不断上升，其中犬的肿瘤性疾病也在日渐增多，目前尚未受到宠物主人的重视。犬的皮肤肿瘤在临床上最常见，约占肿瘤类型的33%[1]。
非甾体抗炎药物通过抑制环氧合酶(Cyclooxygenase COX)的活性，从而抑制花生四烯酸生物合成前列腺素(Prostaglandin PG)，PG产物用来参与机体的多种生理和病理过程，COX是花生四烯酸代谢的限速酶，分为两个亚型 COX-1和COX-2。COX-1在组织细胞中是结构性表达，参与组织的正常生理过程，而COX-2是一种诱导酶，在正常组织中很少有表达，在组织损伤和炎症情况下呈高表达。
目前国内对于犬肿瘤的治疗在采用手术摘除后，大多数病例没有得到确诊，因此犬肿瘤疾病的复发和转移比较常见。免疫组织化学方法在人类肿瘤疾病的诊治和研究中发挥着重要的作用，但在犬肿瘤疾病的研究上还处于起步阶段，而COX-2与犬肿瘤的关系目前国内报道较少。笔者以临床自然发生的犬皮肤及软组织肿瘤病料作为研究对象，对肿瘤进行病理组织学观察，并用免疫组织化学的方法对COX-2在犬皮肤及软组织肿瘤上的表达进行观察，为犬皮肤及软组织肿瘤的临床预防、诊断、治疗和预后提供可靠的临床依据。
1. 材料与方法
1.1材料
1.1.1病料 患犬来源于浙江大学动物医院，通过病史调查及临床检查，初步确定为患有皮肤及软组织肿瘤，通过手术摘除肿瘤，分成大小约1 cm3左右的小组织块，用10%中性福尔马林溶液进行固定。另取犬正常皮肤组织6份作为对照。
1.1.2主要试剂 一抗为小鼠COX-2单克隆抗体(Santa Cruz公司)、 二抗为山羊抗小鼠IgG抗体（Abbike公司）、磷酸盐缓冲液( PBS)（杭州风行水上生物科技有限公司）、二氨基联苯胺( DAB)显色试剂盒（北京中山生物技术有限公司）、SP免疫组化试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。
1.2方法
1.2.1病理组织切片制作 将手术摘除的肿瘤修整为大小约1 cm3 的组织块并固定于10%中性福尔马林溶液中，要求从被膜到深部组织切取完整而全面的组织块，以显示组织器官的完整性。组织块分别经过洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和HE染色。之后按照WHO对犬乳腺肿瘤的分类标准对被检肿瘤进行分类。
1.2.2免疫组化染色 将石蜡切片常规脱蜡、水化；3%H2O2溶液室温孵育10 min；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min；柠檬酸缓冲液微波加热至95 ℃~98 ℃修复抗原10 min；PBS缓冲液水洗，加一抗，37 ℃，湿盒内孵育1 h；PBS缓冲液水洗，加二抗，37 ℃，湿盒内孵育0.25 h；PBS缓冲液水洗；滴加新鲜配制DAB显色液，室温孵育20 min；蒸馏水充分冲洗；复染、脱水、透明、封片。
1.2.3结果判定 COX-2 阳性表达主要是在细胞浆内及细胞核周围特异性的显色出棕黄色颗粒。每张切片分别观察5个视野，综合染色强度和阳性细胞数分布进行半定量分析，其中染色强度评分标准如下：未染色为0分，淡染色为1分，明显染色为2分，强染色为3分；阳性细胞数分布评分标准如下：没有阳性细胞数为0分，阳性细胞数<25%为1分，25%-50%为2分，51%-75%为3分，>75%为4分，将两项评分相加，<1分为阴性表达，2-3分为阳性表达，>3分为强阳性表达[2,3]。
2. 结果
2.1病理组织学分类 根据WHO对犬肿瘤的分类标准将所收集的12例皮肤及软组织肿瘤进行分类[4]。其中良性肿瘤9例，占75%；恶性肿瘤3例，占25%。在9例良性肿瘤中基底细胞瘤1例，纤维瘤1例，血管周细胞瘤1例，皮脂腺瘤2例，皮脂腺上皮瘤2例，毛母细胞瘤2例；在3例恶性肿瘤中皮脂腺癌2例，脂肪肉瘤1例（表1）。
表1 12例犬皮肤及软组织肿瘤的病理类型分布
2.2病理组织学观察 皮脂腺癌镜下可见分叶内的瘤细胞有两种: 一种为未分化的上皮细胞，形似基底细胞瘤的细胞。镜下可见细胞界限模糊，核圆形或椭圆形，胞浆内较少有粉红色细颗粒状或含单个脂滴空泡,；另一种为成熟的皮脂细胞, 形体较大, 呈多边形, 胞浆丰富, 内含无数小空泡,核较小, 位于细胞中央或偏于一侧，有明显的核分裂相（图1-1）。脂肪肉瘤镜下可见大量增殖的胞膜清晰，近于圆形的细胞，胞浆内见有空泡，细胞形态大小不等，核较大，偏于细胞一侧，并可见较多的核异型性（图1-2）。基底细胞瘤镜下可见肿瘤细胞成团块状增殖，由结缔组织分割为不规则小叶状，细胞呈梭形、多边形及近圆形，细胞核圆形，核膜清晰，无明显核分裂相（图1-3）。纤维瘤镜下可见高度增生的真皮，弥散性结缔组织增生，呈无规则交错排列，主要是散在的成纤维细胞和成熟的结缔组织纤维细胞，（图1-4）。血管周细胞瘤镜下可见一个或多个细胞形成管形状，血管周围有增殖的梭形细胞，类似成纤维细胞（图1-5）。皮脂腺瘤镜下可见真皮内的瘤组织呈大小、形态不一的分叶, 其周围环绕薄层结缔组织包膜，分叶内大量未分化的腺上皮细胞和成熟的腺上皮细胞增殖，核异型性不高（图1-6）。毛母细胞瘤镜下可见瘤细胞来源于毛囊基底细胞，细胞胞浆较少，胞核浓染，增生的细胞被包膜包裹，形成类似于毛囊的结构（图1-7）。皮脂腺上皮瘤镜下可见界线不清、不规则生长的细胞团块，呈腺样分布，可与表皮相连，无包膜，类似基底细胞瘤，一部分细胞已明显向皮脂腺分化，而大部分为未分化的细胞（图1-8）。
2.3 COX-2在犬皮肤及软组织肿瘤中的表达 COX-2在犬皮肤及软组织肿瘤中的阳性表达主要位于肿瘤细胞的胞浆内及胞核周围，为棕黄色颗粒。12例皮肤及软组织肿瘤中7例COX-2呈强阳性表达（见图2-1，2-2，2-3，2-4），阳性表达率为58.3%（7/12），正常皮肤中COX-2均无表达（表2）。
表2 COX-2在不同皮肤及软组织肿瘤上的表达情况
3.讨论
3.1犬皮肤及软组织肿瘤手术方法及注意点 瘤体较小者,尽量沿瘤体周围作梭形切口，缝合时对创口进行修剪，避免两端在缝合后形成 “狗耳朵”。当切口张力较大时，充分剥离皮下组织，用可吸收线无张力分层缝合。对于因瘤体过大而切除过多组织的创口，在手术前要设计好皮瓣，将皮瓣与创面边缘缝合，必要时放置引流条[5]。在切除原发性肿瘤时，应将附近的局部淋巴结摘除，以防止转移[6]。
3.2犬皮肤及软组织肿瘤病理组织学鉴别 从瘤体形态看，一般情况下皮肤良性肿瘤界限清晰，有包膜，外观规则，生长缓慢，无压痛，无明显根蒂。而恶性肿瘤表面凹凸不平，多呈菜花状，增长迅速，瘤体常出现出血坏死，有根蒂，周围组织会伴发肿胀疼痛[7]。
皮肤肿瘤主要是由于皮肤的正常组织结构如上皮组织、脂肪组织、纤维结缔组织以及一些肥大细胞等在致病因素下出现的异常增殖。皮肤的附属结构和附属腺体如毛囊和皮脂腺也是皮肤肿瘤的好发部位[8]。
根据组织来源不同WHO对犬皮肤及软组织肿瘤进行分类，包括上皮性肿瘤如基底细胞瘤、基底细胞癌、皮肤乳头状瘤、鳞状细胞癌、毛母细胞瘤、毛发上皮细胞瘤、毛母质瘤、皮脂腺瘤、皮脂腺癌、皮脂腺上皮瘤、汗腺瘤、汗腺癌、耵聍腺瘤、耵聍腺癌、黑色素细胞瘤、恶性黑色素瘤；间质肿瘤如纤维瘤、纤维肉瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、血管周细胞瘤、神经鞘瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、血管瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤；圆细胞瘤如肥大细胞瘤、组织细胞瘤、浆细胞瘤、淋巴瘤、犬传染性性肿瘤。本试验共发现皮脂腺癌、脂肪肉瘤、基底细胞瘤、纤维瘤、血管周细胞瘤、皮脂腺瘤、皮脂腺上皮瘤、毛母细胞瘤等8种肿瘤类型。
3.3 COX-2与犬皮肤及软组织肿瘤的关系
目前大量研究证实COX-2在消化道肿瘤、乳腺癌、泌尿生殖道肿瘤中存在高表达，使得COX-2与肿瘤的关系受到了人们的重视，已经了解到的致瘤机理主要有：刺激肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡、抑制机体免疫反应、促进肿瘤新生血管形成、以及增加肿瘤细胞的侵袭性和转移能力等。
检测COX-2在皮肤肿瘤组织中表达和动物学实验等方面的证据表明，COX-2与皮肤肿瘤的发生发展有密切关系。有资料研究表明COX-2在许多皮肤癌前病变中存在表达，而在正常皮肤中的表达较少，说明COX-2的表达可作为皮肤癌的早期诊断[9,10]。有研究证明 COX-2 的过表达与多种皮肤肿瘤的发生发展有着密切关系[11,12]。资料研究发现在人和动物模型的皮肤肿瘤中，COX-2在皮肤原位癌和鳞状细胞癌组织中表达明显上升，从而认为COX-2的表达可作为鳞状细胞来源的皮肤肿瘤的提示[13]。汪雁等研究发现COX-2在皮肤基底细胞癌中的阳性表达率为60.3%，与其在正常皮肤组织中的表达差异显著，提示COX-2的表达与皮肤基底细胞瘤的发生发展有关[14]。华海康通过对118例皮肤肿瘤组织和20例正常皮肤组织中 COX-2 的表达，发现在不同皮肤肿瘤组织中COX-2的表达率不同，而正常皮肤中表达为阴性[15]。
本研究结果显示12例皮肤及软组织肿瘤中7例COX-2呈强阳性表达，阳性表达率为58.3%，正常皮肤中COX-2均无表达。COX-2在皮肤及软组织肿瘤和正常皮肤上的表达差异有统计学意义（P<0.05），提示COX-2的高表达与犬皮肤及软组织肿瘤的发生发展密切相关。
关键词：犬；皮肤及软组织；肿瘤；病理组织；免疫组化；环氧合酶-2
随着我国宠物犬的养殖数量不断增加，各种犬病的发生率也不断上升，其中犬的肿瘤性疾病也在日渐增多，目前尚未受到宠物主人的重视。犬的皮肤肿瘤在临床上最常见，约占肿瘤类型的33%[1]。
非甾体抗炎药物通过抑制环氧合酶(Cyclooxygenase COX)的活性，从而抑制花生四烯酸生物合成前列腺素(Prostaglandin PG)，PG产物用来参与机体的多种生理和病理过程，COX是花生四烯酸代谢的限速酶，分为两个亚型 COX-1和COX-2。COX-1在组织细胞中是结构性表达，参与组织的正常生理过程，而COX-2是一种诱导酶，在正常组织中很少有表达，在组织损伤和炎症情况下呈高表达。
目前国内对于犬肿瘤的治疗在采用手术摘除后，大多数病例没有得到确诊，因此犬肿瘤疾病的复发和转移比较常见。免疫组织化学方法在人类肿瘤疾病的诊治和研究中发挥着重要的作用，但在犬肿瘤疾病的研究上还处于起步阶段，而COX-2与犬肿瘤的关系目前国内报道较少。笔者以临床自然发生的犬皮肤及软组织肿瘤病料作为研究对象，对肿瘤进行病理组织学观察，并用免疫组织化学的方法对COX-2在犬皮肤及软组织肿瘤上的表达进行观察，为犬皮肤及软组织肿瘤的临床预防、诊断、治疗和预后提供可靠的临床依据。
1. 材料与方法
1.1材料
1.1.1病料 患犬来源于浙江大学动物医院，通过病史调查及临床检查，初步确定为患有皮肤及软组织肿瘤，通过手术摘除肿瘤，分成大小约1 cm3左右的小组织块，用10%中性福尔马林溶液进行固定。另取犬正常皮肤组织6份作为对照。
1.1.2主要试剂 一抗为小鼠COX-2单克隆抗体(Santa Cruz公司)、 二抗为山羊抗小鼠IgG抗体（Abbike公司）、磷酸盐缓冲液( PBS)（杭州风行水上生物科技有限公司）、二氨基联苯胺( DAB)显色试剂盒（北京中山生物技术有限公司）、SP免疫组化试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。
1.2方法
1.2.1病理组织切片制作 将手术摘除的肿瘤修整为大小约1 cm3 的组织块并固定于10%中性福尔马林溶液中，要求从被膜到深部组织切取完整而全面的组织块，以显示组织器官的完整性。组织块分别经过洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和HE染色。之后按照WHO对犬乳腺肿瘤的分类标准对被检肿瘤进行分类。
1.2.2免疫组化染色 将石蜡切片常规脱蜡、水化；3%H2O2溶液室温孵育10 min；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min；柠檬酸缓冲液微波加热至95 ℃~98 ℃修复抗原10 min；PBS缓冲液水洗，加一抗，37 ℃，湿盒内孵育1 h；PBS缓冲液水洗，加二抗，37 ℃，湿盒内孵育0.25 h；PBS缓冲液水洗；滴加新鲜配制DAB显色液，室温孵育20 min；蒸馏水充分冲洗；复染、脱水、透明、封片。
1.2.3结果判定 COX-2 阳性表达主要是在细胞浆内及细胞核周围特异性的显色出棕黄色颗粒。每张切片分别观察5个视野，综合染色强度和阳性细胞数分布进行半定量分析，其中染色强度评分标准如下：未染色为0分，淡染色为1分，明显染色为2分，强染色为3分；阳性细胞数分布评分标准如下：没有阳性细胞数为0分，阳性细胞数<25%为1分，25%-50%为2分，51%-75%为3分，>75%为4分，将两项评分相加，<1分为阴性表达，2-3分为阳性表达，>3分为强阳性表达[2,3]。
2. 结果
2.1病理组织学分类 根据WHO对犬肿瘤的分类标准将所收集的12例皮肤及软组织肿瘤进行分类[4]。其中良性肿瘤9例，占75%；恶性肿瘤3例，占25%。在9例良性肿瘤中基底细胞瘤1例，纤维瘤1例，血管周细胞瘤1例，皮脂腺瘤2例，皮脂腺上皮瘤2例，毛母细胞瘤2例；在3例恶性肿瘤中皮脂腺癌2例，脂肪肉瘤1例（表1）。
表1 12例犬皮肤及软组织肿瘤的病理类型分布
2.2病理组织学观察 皮脂腺癌镜下可见分叶内的瘤细胞有两种: 一种为未分化的上皮细胞，形似基底细胞瘤的细胞。镜下可见细胞界限模糊，核圆形或椭圆形，胞浆内较少有粉红色细颗粒状或含单个脂滴空泡,；另一种为成熟的皮脂细胞, 形体较大, 呈多边形, 胞浆丰富, 内含无数小空泡,核较小, 位于细胞中央或偏于一侧，有明显的核分裂相（图1-1）。脂肪肉瘤镜下可见大量增殖的胞膜清晰，近于圆形的细胞，胞浆内见有空泡，细胞形态大小不等，核较大，偏于细胞一侧，并可见较多的核异型性（图1-2）。基底细胞瘤镜下可见肿瘤细胞成团块状增殖，由结缔组织分割为不规则小叶状，细胞呈梭形、多边形及近圆形，细胞核圆形，核膜清晰，无明显核分裂相（图1-3）。纤维瘤镜下可见高度增生的真皮，弥散性结缔组织增生，呈无规则交错排列，主要是散在的成纤维细胞和成熟的结缔组织纤维细胞，（图1-4）。血管周细胞瘤镜下可见一个或多个细胞形成管形状，血管周围有增殖的梭形细胞，类似成纤维细胞（图1-5）。皮脂腺瘤镜下可见真皮内的瘤组织呈大小、形态不一的分叶, 其周围环绕薄层结缔组织包膜，分叶内大量未分化的腺上皮细胞和成熟的腺上皮细胞增殖，核异型性不高（图1-6）。毛母细胞瘤镜下可见瘤细胞来源于毛囊基底细胞，细胞胞浆较少，胞核浓染，增生的细胞被包膜包裹，形成类似于毛囊的结构（图1-7）。皮脂腺上皮瘤镜下可见界线不清、不规则生长的细胞团块，呈腺样分布，可与表皮相连，无包膜，类似基底细胞瘤，一部分细胞已明显向皮脂腺分化，而大部分为未分化的细胞（图1-8）。
2.3 COX-2在犬皮肤及软组织肿瘤中的表达 COX-2在犬皮肤及软组织肿瘤中的阳性表达主要位于肿瘤细胞的胞浆内及胞核周围，为棕黄色颗粒。12例皮肤及软组织肿瘤中7例COX-2呈强阳性表达（见图2-1，2-2，2-3，2-4），阳性表达率为58.3%（7/12），正常皮肤中COX-2均无表达（表2）。
表2 COX-2在不同皮肤及软组织肿瘤上的表达情况
3.讨论
3.1犬皮肤及软组织肿瘤手术方法及注意点 瘤体较小者,尽量沿瘤体周围作梭形切口，缝合时对创口进行修剪，避免两端在缝合后形成 “狗耳朵”。当切口张力较大时，充分剥离皮下组织，用可吸收线无张力分层缝合。对于因瘤体过大而切除过多组织的创口，在手术前要设计好皮瓣，将皮瓣与创面边缘缝合，必要时放置引流条[5]。在切除原发性肿瘤时，应将附近的局部淋巴结摘除，以防止转移[6]。
3.2犬皮肤及软组织肿瘤病理组织学鉴别 从瘤体形态看，一般情况下皮肤良性肿瘤界限清晰，有包膜，外观规则，生长缓慢，无压痛，无明显根蒂。而恶性肿瘤表面凹凸不平，多呈菜花状，增长迅速，瘤体常出现出血坏死，有根蒂，周围组织会伴发肿胀疼痛[7]。
皮肤肿瘤主要是由于皮肤的正常组织结构如上皮组织、脂肪组织、纤维结缔组织以及一些肥大细胞等在致病因素下出现的异常增殖。皮肤的附属结构和附属腺体如毛囊和皮脂腺也是皮肤肿瘤的好发部位[8]。
根据组织来源不同WHO对犬皮肤及软组织肿瘤进行分类，包括上皮性肿瘤如基底细胞瘤、基底细胞癌、皮肤乳头状瘤、鳞状细胞癌、毛母细胞瘤、毛发上皮细胞瘤、毛母质瘤、皮脂腺瘤、皮脂腺癌、皮脂腺上皮瘤、汗腺瘤、汗腺癌、耵聍腺瘤、耵聍腺癌、黑色素细胞瘤、恶性黑色素瘤；间质肿瘤如纤维瘤、纤维肉瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、血管周细胞瘤、神经鞘瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、血管瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤；圆细胞瘤如肥大细胞瘤、组织细胞瘤、浆细胞瘤、淋巴瘤、犬传染性性肿瘤。本试验共发现皮脂腺癌、脂肪肉瘤、基底细胞瘤、纤维瘤、血管周细胞瘤、皮脂腺瘤、皮脂腺上皮瘤、毛母细胞瘤等8种肿瘤类型。
3.3 COX-2与犬皮肤及软组织肿瘤的关系
目前大量研究证实COX-2在消化道肿瘤、乳腺癌、泌尿生殖道肿瘤中存在高表达，使得COX-2与肿瘤的关系受到了人们的重视，已经了解到的致瘤机理主要有：刺激肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡、抑制机体免疫反应、促进肿瘤新生血管形成、以及增加肿瘤细胞的侵袭性和转移能力等。
检测COX-2在皮肤肿瘤组织中表达和动物学实验等方面的证据表明，COX-2与皮肤肿瘤的发生发展有密切关系。有资料研究表明COX-2在许多皮肤癌前病变中存在表达，而在正常皮肤中的表达较少，说明COX-2的表达可作为皮肤癌的早期诊断[9,10]。有研究证明 COX-2 的过表达与多种皮肤肿瘤的发生发展有着密切关系[11,12]。资料研究发现在人和动物模型的皮肤肿瘤中，COX-2在皮肤原位癌和鳞状细胞癌组织中表达明显上升，从而认为COX-2的表达可作为鳞状细胞来源的皮肤肿瘤的提示[13]。汪雁等研究发现COX-2在皮肤基底细胞癌中的阳性表达率为60.3%，与其在正常皮肤组织中的表达差异显著，提示COX-2的表达与皮肤基底细胞瘤的发生发展有关[14]。华海康通过对118例皮肤肿瘤组织和20例正常皮肤组织中 COX-2 的表达，发现在不同皮肤肿瘤组织中COX-2的表达率不同，而正常皮肤中表达为阴性[15]。
本研究结果显示12例皮肤及软组织肿瘤中7例COX-2呈强阳性表达，阳性表达率为58.3%，正常皮肤中COX-2均无表达。COX-2在皮肤及软组织肿瘤和正常皮肤上的表达差异有统计学意义（P<0.05），提示COX-2的高表达与犬皮肤及软组织肿瘤的发生发展密切相关。
