1863年, 冲田总司与冲田林太郎一起加入浪士组前往京都。(上京之后, 林太郎又回江戸成为新徴组组头)。冲田在浪士组分裂之后和近藤勇等人留下来组织新选组、之后成为新选组副长助勤。在这个时期,冲田亲自参与了新选组局长芹泽鸭、内山彦次郎的暗杀行动。
1864年,冲田活跃於池田屋事件,砍倒数名尊王攘夷志士。史上吉田稔麿不是冲田斩杀的。(冲田斩杀了吉田是子母泽宽与司马辽太郎的虚构。) 冲田在池田屋中突然因肺结核晕倒(有各种说法)。但是在那之后的新选组历史中,冲田依然相当活跃,实在很难想像在那一天曾经发病。
1865年新选组队士再编成冲田成为一番队组长。 冲田所领导的一番队总能完善达成重要的任务,据说即使在剑豪云集的新选组之中,剑技也是数一数二。
1865年2月,在新选组总长山南敬助的脱逃事件中,冲田被遣去追返,在近江草津将其逮捕。2月23日(1865/3/20), 山南在冲田介错之下切腹。(介错 意指待在将切腹的人身边,在那个人举刀刺向腹部同时,斩下其首级,助其死亡的人。)虽然冲田一直都像对待兄长一样地仰慕山南,但是在他的家书中关於山南的死却仅轻轻带过。
1867年以后,由於病情,冲田由最前线沉寂下来。鸟羽伏见之战,冲田因无法参战而被护送至大坂。败战之后,他和队士沿海路回到江户,在参加甲阳镇抚队途中不得已而脱队(有各种说法)。在江戸开城旧幕军北上前后, 林太郎和阿光忍痛把冲田一个人委托在江户疗养, 一家赶赴支配新徴组的庄内藩(1872年林太郎一家回东京)。之后冲田便投靠幕臣松本良顺,被藏匿在浅草今户的松本良顺家(一说为千驮谷植木屋平五郎家的客舍),於1868年,在近藤勇遭斩首2个月后仍未获知死讯的情况之下死去。同日夜间遗体被送到现东京都港区元麻布三丁目的専称寺. 悄悄埋葬了。専称寺寛永年间起是冲田家的菩提寺(冲田家累代之墓)。