蛋白激酶(protein kinases)，是一类催化蛋白质磷酸化反应的酶。它能把腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate, ATP)上的γ-磷酸转移并共价结合到特定蛋白质分子中某些丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的羟基上，从而改变底物蛋白质及激酶的构象和活性。蛋白激酶内都存在一个同源的由约270个氨基酸残基构成的催化结构区。在细胞信号传导、细胞周期调控等系统中，各种蛋白激酶形成了纵横交错的网络，在细胞的生命活动中起了广泛的作用。
蛋白激酶按照对底物磷酸化位点的选择性，可分为受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、细胞周期依赖型激酶等。理论上凡是能检测到磷酸化产物的方法均可用于蛋白激酶的生化活性检测。但每种检测方法都需要根据激酶和底物的性质作出相应调整。
蛋白激酶抑制剂按照是否与ATP结合位点的“铰链区”结合及是否结合激酶的活性构象可分为4种类型。其中I型和II型的抑制剂构成了最常见的ATP竞争性抑制剂。
1、检测方法
由于以蛋白激酶作为靶点的一系列药物的成功开发，各个试剂公司竞相开发相关的激酶检测方法和试剂盒，用于筛选和优化新的化合物作为新药候选者。其中以蛋白激酶的生化检测方法最为繁多，表3给出了一些常用检测方法、激酶抑制剂筛选试剂服务以及检测设备提供商。
蛋白激酶的生化检测方法有2种不同的分类：
按照检测目标分类或者按照检测的方法学进行分类。
按照检测目标，可以分为检测ATP的消耗量、检测ADP的生成量、检测多肽底物以及检测激酶本身；
而按照检测的方法学分类，则有同位素标记分析法、质谱、核磁共振、反相高效液相色谱、毛细管电泳、生化检测方法等诸多手段。
虽然上述方法早已经见诸报道并被广泛应用，然而，现在最经常使用的还是放射性同位素标记ATP，荧光标记(包括荧光偏振\荧光共轭能量转移\时间分辨荧光以及化学发光等)检测方法。这些方法均以微孔板作为载体，具有试剂消耗量低，检测速度快，通量高的优点，成为较普遍应用的一些蛋白激酶检测方法。表4是常见的蛋白激酶生化检测方法的列举及优缺点比较。
1.1、放射性同位素法
使用放射性同位素方法有诸多优点：它是直接检测的方法，放射性同位素的灵敏度很高，测试结果非常准确，被认为是蛋白激酶生化活性检测的“金标准”。因此，至今还有很多人继续使用放射性同位素作为检测激酶活性的方法。放射性同位素方法主要有膜过滤法和接近闪烁计数法两类。
放射性同位素方法有以下一些缺点：
(1)产生大量的放射性垃圾，对人体有一定的损害；
(2)放射性ATP的半衰期非常短，只有14天(32P)或者25天(33P)，因此需要经常订购新的同位素；
(3)放射性同位素的能量非常高，有比较明显的交叉干扰现象，较难应用于化合物的高通量或者超高通量筛选。
1.2、非均相非放射性同位素法
由于放射性同位素存在上述一些缺点，科学家们开发了众多的非放射性激酶检测方法，包括酶联免疫法、高效液相色谱法、质谱法、核磁共振波谱法、毛细管电泳等。
1.3、均相非放射性同位素法
上述这些非均相的方法，存在操作繁多的问题。随着技术的发展，越来越多的均相非放射性方法开始被应用于激酶活性的检测之中，根据实验原理的不同，可以分为检测ATP的量、检测ADP的量、检测带标记或修饰的多肽底物、配体激酶结合法等。
1.3.1 检测剩余ATP的量
有些方法可以利用测定激酶反应中未被消耗掉的ATP量来检测酶活，例如Promega公司的Kinase-Glo™技术。该方法利用激酶反应后剩余的ATP，将荧光素转化为氧化荧光素，并发出化学冷光，荧光信号值与激酶活性成反比。该试剂盒里的重组热稳定荧光素酶(Ultra-GloTM)，发出稳定的“辉光”型荧光，半衰期大于5个小时，不需要配套进样器的荧光仪，可成批处理大量的微孔板。Ultra-GloTM发出的稳定荧光可适用于多种检测条件，与特定的缓冲液组成相搭配，可减少来自化合物的自发荧光的干扰。
该检测方法的成本很低，但为了产生大于2倍的信噪比，至少需要50%的转化率，因此不能用于进行激酶性质的研究，但在ATP产生50%~80%转化率的时候，抑制剂的活性的偏移在2到3倍之间，处于可以接受的范围，因此该方法可适用于抑制剂的高通量筛选。
1.3.2 检测ADP的生成量
该类方法较易检测一些非多肽底物的激酶活性，如脂激酶，同时也可以测定一些ATP酶的活性。该类方法又可以分为ADP偶联反应，即将ADP转化成其他物质并进行检测，例如Promega的ADP-GloTM；依靠ADP抗体检测的方法，例如Invitrogen的Adapta®，Cisbio的Transcreener®等方法。
蛋白激酶按照对底物磷酸化位点的选择性，可分为受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、细胞周期依赖型激酶等。理论上凡是能检测到磷酸化产物的方法均可用于蛋白激酶的生化活性检测。但每种检测方法都需要根据激酶和底物的性质作出相应调整。
蛋白激酶抑制剂按照是否与ATP结合位点的“铰链区”结合及是否结合激酶的活性构象可分为4种类型。其中I型和II型的抑制剂构成了最常见的ATP竞争性抑制剂。
1、检测方法
由于以蛋白激酶作为靶点的一系列药物的成功开发，各个试剂公司竞相开发相关的激酶检测方法和试剂盒，用于筛选和优化新的化合物作为新药候选者。其中以蛋白激酶的生化检测方法最为繁多，表3给出了一些常用检测方法、激酶抑制剂筛选试剂服务以及检测设备提供商。
蛋白激酶的生化检测方法有2种不同的分类：
按照检测目标分类或者按照检测的方法学进行分类。
按照检测目标，可以分为检测ATP的消耗量、检测ADP的生成量、检测多肽底物以及检测激酶本身；
而按照检测的方法学分类，则有同位素标记分析法、质谱、核磁共振、反相高效液相色谱、毛细管电泳、生化检测方法等诸多手段。
虽然上述方法早已经见诸报道并被广泛应用，然而，现在最经常使用的还是放射性同位素标记ATP，荧光标记(包括荧光偏振\荧光共轭能量转移\时间分辨荧光以及化学发光等)检测方法。这些方法均以微孔板作为载体，具有试剂消耗量低，检测速度快，通量高的优点，成为较普遍应用的一些蛋白激酶检测方法。表4是常见的蛋白激酶生化检测方法的列举及优缺点比较。
1.1、放射性同位素法
使用放射性同位素方法有诸多优点：它是直接检测的方法，放射性同位素的灵敏度很高，测试结果非常准确，被认为是蛋白激酶生化活性检测的“金标准”。因此，至今还有很多人继续使用放射性同位素作为检测激酶活性的方法。放射性同位素方法主要有膜过滤法和接近闪烁计数法两类。
放射性同位素方法有以下一些缺点：
(1)产生大量的放射性垃圾，对人体有一定的损害；
(2)放射性ATP的半衰期非常短，只有14天(32P)或者25天(33P)，因此需要经常订购新的同位素；
(3)放射性同位素的能量非常高，有比较明显的交叉干扰现象，较难应用于化合物的高通量或者超高通量筛选。
1.2、非均相非放射性同位素法
由于放射性同位素存在上述一些缺点，科学家们开发了众多的非放射性激酶检测方法，包括酶联免疫法、高效液相色谱法、质谱法、核磁共振波谱法、毛细管电泳等。
1.3、均相非放射性同位素法
上述这些非均相的方法，存在操作繁多的问题。随着技术的发展，越来越多的均相非放射性方法开始被应用于激酶活性的检测之中，根据实验原理的不同，可以分为检测ATP的量、检测ADP的量、检测带标记或修饰的多肽底物、配体激酶结合法等。
1.3.1 检测剩余ATP的量
有些方法可以利用测定激酶反应中未被消耗掉的ATP量来检测酶活，例如Promega公司的Kinase-Glo™技术。该方法利用激酶反应后剩余的ATP，将荧光素转化为氧化荧光素，并发出化学冷光，荧光信号值与激酶活性成反比。该试剂盒里的重组热稳定荧光素酶(Ultra-GloTM)，发出稳定的“辉光”型荧光，半衰期大于5个小时，不需要配套进样器的荧光仪，可成批处理大量的微孔板。Ultra-GloTM发出的稳定荧光可适用于多种检测条件，与特定的缓冲液组成相搭配，可减少来自化合物的自发荧光的干扰。
该检测方法的成本很低，但为了产生大于2倍的信噪比，至少需要50%的转化率，因此不能用于进行激酶性质的研究，但在ATP产生50%~80%转化率的时候，抑制剂的活性的偏移在2到3倍之间，处于可以接受的范围，因此该方法可适用于抑制剂的高通量筛选。
1.3.2 检测ADP的生成量
该类方法较易检测一些非多肽底物的激酶活性，如脂激酶，同时也可以测定一些ATP酶的活性。该类方法又可以分为ADP偶联反应，即将ADP转化成其他物质并进行检测，例如Promega的ADP-GloTM；依靠ADP抗体检测的方法，例如Invitrogen的Adapta®，Cisbio的Transcreener®等方法。
