1.2.1 脂肪酶的研究概况
脂肪酶可以根据其来源分类，分为微生物脂肪酶、动物脂肪酶和植物脂肪酶。脂肪酶可以很容易地从微生物真菌（如南极洲假丝酵母）或细菌（如荧光假单胞菌）中通过发酵过程高产量地生产出来，其过程缺乏基本的净化步骤。一些脂肪酶表现出对底物的位置专一性，而另一些则不然。对不同来源的游离脂肪酶类型的比较研究表明，荧光P.脂肪酶具有最高的酶活性。通常，来自真菌来源的脂肪酶比来自细菌来源的脂肪酶表现出更好的甘油三酯酯交换活性。
作为一种多功能生物催化剂，脂肪酶具有其他酶蛋白无法比拟的优点[15]：1、在有机溶剂中具有良好的稳定性；2、催化过程不需要辅助因子，一般不发生副反应；3、可以催化水解，酯化，酯交换等众多反应[16]；4、具有独特的化学选择性、区域选择性及立体选择性；5、底物谱广，可催化非天然底物进行反应。与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶生产周期短，分离纯化相对简单，并可利用基因工程和蛋白质工程等技术实现酶的改造并构建生产工程菌[17]，适合工业化生产与应用。1994年，丹麦Novozymes公司首次应用基因工程菌生产来源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶Lipolase，此后许多来源于微生物的脂肪酶也实现了商业化生产[18]。脂肪酶的应用领域日益扩大，被广泛运用于生物柴油、食品加工、面粉改良、造纸造酒、有机合成等化工领域[19]。
1.2.2 脂肪酶的结构及催化机制
脂肪酶是一类重要的水解酶，催化三酰甘油酯中酯键的裂解，具有广泛的生物技术应用价值。脂肪酶是在人体内正确分配和利用油脂所必需的酶。脂蛋白脂肪酶(LPL)在毛细血管中很活跃，它通过水解包装脂蛋白中的甘油三酯，在防止血脂异常方面起着至关重要的作用。30年前，有人提出了一种不活泼的LPL低聚物的存在。M., TusharRanjan (2020)指出天然油中高浓度的omega- 3脂肪酸(ɷ-3 FAs)对于维持身体健康非常重要。脂肪酶是一种很有前途的富集催化剂，但脂肪酶的脂肪酸特异性较差。
在脂肪酶催化酯键水解的过程中，活性酶的构象和四面体跃迁态的稳定都是至关重要的。利用蛋白酶定点突变实验的x射线结构数据和结果已被用作预测可能在脂肪酶中起关键作用的氨基酸残基的基础。克隆了根霉脂肪酶基因，并在大肠杆菌中表达。该基因的定点突变被用来测试计算机辅助预测特定氨基酸在该酶中的功能作用的有效性。通过对米根霉脂肪酶变异体的动力学常数的检测，我们可以识别出直接参与催化反应或稳定酶活性几何结构的氨基酸残基。这些结果与分子力学模拟相结合，基于同源衍生的结构模型，提供了关于结构-功能关系的新信息。对数据的解释与其他水解酶(如蛋白酶)的结果一致。
1.3 固定化酶1.3.1 固定化酶的意义
固定化酶是相对于游离酶而言，是指将能自由移动的游离酶限定不能自由活动的过程，常被用于修饰生物酶。固定化酶的主要作用是提高酶的产酶率和操作稳定性，同时促进酶的再利用。因此，作为生化催化剂，固定化酶相比游离酶有着先天的优势，其反应过程更简单、更容易操作、可多次使用、成本相对低廉、催化速度更快、不易污染、更易于从反应混合物中分离而不污染产物等。
1.3.2 固定化酶的制备方法
酶固定化方法大体上可以分为物理法和化学法，其中物理法包括吸附法、包埋法；其余比如交联法、结合法、离子法属于化学方法。
1.3.2.1物理方法
（1）吸附法
吸附法一般指的是包括离子吸附在内的物理吸附。物理吸附指将酶附着于载体上，它不改变酶的结构，酶的活性几乎不受影响，酶的活性保持较好。但也有缺点，就是酶与其载体连接性不够好，容易分离，而且吸附后产生酶的活性不够高。
离子吸附属于特殊的物理吸附，其载体是特殊的水不溶性载体，和普通的物理吸附一样，活性几乎不受影响和弱化，产生的固定化酶活性，相比普通的物理吸附更高。
（2）包埋法
包埋法也是一种物理法，其不改变酶的分子结构，就是将酶包埋在孔状载体中使其固定化的过程。包埋系统条件要求较低，包埋法适用范围较广，不发生化学反应，酶的活性和稳定性保持较好。包埋法常用于污水处理，如果要用于食品、药品生产催化，对包埋材料的无毒无害性有严格要求。
1.3.2.1化学方法
（1）交联法
交联法是一种化学固定化酶的方法，采用交联试剂将酶内部分子、酶分子与载体分子、酶分子与惰性蛋白分子发生化学反应，形成共价键。该方法可以使包括酶在内的交联物分子结构变得更复杂，提升酶的活性和稳定性。但由于交联剂价格一般很昂贵、采用此方法成本太高，所以一般不单独使用，常结合其他方法，比如吸附或包埋法，既固化酶，又提高酶的活力。
（2）结合法
结合法无论是采用离子键还是共价键进行结合，都改变分子结构，属于化学方法。离子键结合法顾名思义采用的载体是离子交换剂，该方法操作简易、酶的活性保持较好，但是酶与载体结合不紧密，当外部环境发生变化时，容易发生分离。共价键结合法相比离子键结合法，恰好相反，操作复杂、对载体要求较高，但酶与载体结合紧密，酶不易与载体分离，使用时间相比离子键结合法能长很多。
1.3.3 新型固定化酶技术
开发新一代固定化酶，应充分利用快速发展的遗传技术、有机化学、计算化学和生物信息学、反应器和反应设计等科学技术。为了提高酶的产量，无论是独立的或作为催化级联过程，工业生物催化剂必须考虑酶的多种生物转化，从而提高成本效益。
新型固定化酶的大规模生产进展缓慢，这与它们较高的成本和储存问题有关。科学家和工业生产者需要加强合作，促使固定化酶的新矩阵和交叉连接物就可以更好地适应不同的化学过程。因此，深入了解如何实现高功能酶固定化方案非常有必要。在合适的底物支持下，需考虑到交叉连接和预先的应用等固定化生物催化剂。为了实现工业水平的绿色酶过程，需要为研究稳定酶的可用性以及酶的固定-稳定和再活化开发出有效的策略[29-31]。
1.3.3.1基于新型固定化载体的固定化酶技术
（1）金属有机框架固定化酶
金属有机框架（Metal-Organic Frameworks, MOF）是一种新型的固定化酶的材料[32]。该材料由于其多孔隙、比表面积相对较大、孔径可收放、金属位点开放等特征，近年来被广泛用于固定化酶，具体技术可分为物理吸附、化学连接和牢笼包埋[33]。
传统的固定化酶系统由于缺乏对酶的定位、底物和产物的扩散、酶和辅酶的可及性等方面的最优空间控制，难以实现高效的无细胞酶系统。Li（2018）提出一个策略来扩大以锌为本底的金属有机框架（mof）（称为 NU-100 x, x = 3, 4, 5, 6, 7）的孔隙孔径（从3.3到6.7海里）。通过维护扭转角度的精确控制与连接器，来实现与不同孔径的孔隙进行关联。为了验证，使用扩展的NU-100x MOF结构来封装乳酸脱氢酶（LDH），并演示在无细胞生物合成催化系统中使用捕获的蛋白质。值得注意的是，固定化于MOF大孔中的LDH可被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶（NAD和NADH）利用，允许原位辅酶再生，使LDH的活性高于游离酶。
（2）新型纳米材料载体固定化酶
随着纳米科学和技术的迅速突破，且纳米材料由于其拥有极大的比表面积和良好的载荷性，常被用来固定化酶。
尽管作为蛋白质分析的黄金标准，经典的酶联免疫吸附试验(ELISA)目前受到越来越多的敏感性和简洁性需求的挑战。针对当前的需求，纳米材料的最新进展为提高酶联免疫吸附试验的性能和扩大其适用性提供了许多有希望的工具。介绍了纳米材料支持的策略，在不显著改变传统ELISA格式的情况下，显著提高了分析性能。将特别关注纳米材料作为酶联免疫吸附试验中新型读出系统的功能作用，包括作为基质替代品、酶替代品和非酶信号放大器的作用。
纳米粒子已广泛应用于多种酶的固定化。然而，酶在NPs上的稳定是一个主要的挑战，对调节酶的活性及其在医学上的应用至关重要。为了克服这些挑战，有必要探索酶是如何附着在纳米材料上的，以及酶的性质如何受到这些相互作用的影响。Sharifi M.（2020）指出固定化酶进入NPs的不同策略及其相应的抗温度和ph的稳定性，总结了表面电荷、颗粒大小、形态和聚集等因素对固定化酶稳定性的影响。综述了固定化酶在NPs中的活性，揭示了生物分子与NPs相互作用的更多细节。
c. 磁性材料载体固定化酶
磁性材料利用其特有的磁性，改变分子粒子运动轨迹，从而实现固定化酶的目的。胰凝乳蛋白酶已被固定在几种非多孔磁性材料上。镍颗粒被认为是最合适的磁性固定化酶载体。固定化在无孔磁性载体上的胰凝乳蛋白酶未被全脂牛奶或澄清酵母匀浆严重污染。这两种物质都迅速污染了AE -纤维素-胰凝乳蛋白酶，而固定化到丙烯酸基离子交换器中的胰凝乳蛋白酶则缓慢地被污染。无孔岩石磁性颗粒的固定化酶活性与颗粒直径成反比。采用吸附固定和戊二醛交联的方法在颗粒上制备适量的胰凝乳蛋白酶。酯水解活性随酶负荷的增加而增加，而酪蛋白水解活性不增加。胰凝乳蛋白酶被来自磁性载体的金属离子抑制。它的部分保护是使用一个初步的蛋白质涂层，并可能被重新激活与EDTA或BSA孵化[40]。
Lei等[41]制备了含有羧基的磁性纳米微球，经氯化亚砜活化，使木瓜蛋白酶与载体的氯酰基团结合。固定化的木瓜蛋白酶相比于游离酶稳定性提高，并可重复使用。Alpay等[42]利用乳液聚合技术合成了磁性纳米颗粒，使用活性蓝(F3GA)对纳米颗粒进行改性，发现在pH为7.0时对木瓜蛋白酶达到最大吸附量，得到的固定化酶表现出良好的pH和温度稳定性。Cao等[43]使用涂有金纳米层的Fe3O4固定木瓜蛋白酶，Fe3O4纳米磁性颗粒系统与游离酶相比具有更高的催化活性和酶解效率，制备的Fe3O4作为固定化酶的载体性能优于常规的固定化载体，并且使用硼氢化钠可以除去该系统表面的失活酶，从而恢复固定酶的活力。Jiang等[44]制备了磁性壳聚糖微球，并通过吸附和交联两种作用相结合对漆酶进行了固定，固定后漆酶的热稳定性和贮存稳定性大大提高。
1.4 核苷类化合物及核苷酯类衍生物1.4.1 概述
核苷类化合物是一种非常重要的多羟基化合物，在临床医药[45]和功能性高分子材料等领域具有重要的应用价值。核苷类药物是临床上用于抗癌以及治疗病毒类疾病的主要药物，在抗病毒的药物中，核苷类化合物占半数以上，一直都受到广泛关注。6-巯基嘌呤和6-巯基鸟嘌呤是最早应用于抗肿瘤治疗的嘌呤核苷类似物；脱氧核苷类药物，Fludarabine主要应用于慢性淋巴细胞白血病的治疗，Cladribine主要应用于非霍金淋巴瘤的治疗；阿糖胞苷是用于治疗急性骨髓性白血病的脱氧胞嘧啶核苷类似物；氟嘧啶尿苷中的2'-脱氧-5-氟尿嘧啶核苷（Floxuridine, FUdR）对胰腺癌、胸腺癌、结肠癌都有很好的治疗效果，5'-脱氧-5-氟尿嘧啶核苷（Dloxuridine, DFUR）是用于治疗胃癌、结肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、乳腺癌的药物。
然而在临床应用中，核苷类药物也存在着自己的缺陷和不足，比如毒副作用大、口服生物利用率低等问题，因此对核苷类化合物进行结构修饰是核苷类药物研究的一个重要方向。众多研究表明，核苷酯类衍生物具有比原药更高的抗病毒和抗肿瘤活性，抗癌和抗病毒谱更广，同时口服生物利用度也得到了一定的改善，并延长了作用时间。例如泛昔洛韦是阿昔洛韦L-缬氨酰酯，经过结构修饰后改善了阿昔洛韦在口服给药时吸收不良的缺点，用药后能够在肠道内更好低吸收，通过酶的水解后可以完全转变为无环鸟苷，增加了无环鸟苷的生物利用度[49]。泰诺福韦的氨基酸酰胺衍生物的抗HIV活性和抗病毒活性都较原药明显提高。
1.4.2 核苷类化合物的结构修饰
由于核苷类化合物的结构通常含有多个官能团，在核苷及其类似物的合成制备当中，对特定的结构进行保护是能避免副反应发生的有效途径。然而核苷的糖基上羟基众多，利用化学法直接酰化会有反应选择性差，目的产物产率低且分离困难等问题，且对环境不友好。
Wang C（2010） 研究表明，与主要的平衡核苷转运蛋白不同，集中核苷转运蛋白(CNTs)缺乏有效的特异性抑制剂。该研究新建立的稳定表达hCNT1或hCNT2的PK15NTD转染细胞中，并在之前建立的PK15NTD/hCNT3细胞中，苯并吡喃酮衍生物及其相关化合物与人类(h) CNTs的相互作用。黄酮类化合物对hCNT2和hCNT3的抑制活性最高，而对hCNT1的选择性最强的抑制剂是香豆素衍生物。hCNT3是对查耳酮类药物表现出中等敏感性的唯一转运蛋白。最有效的化合物是6-羟基-7-甲氧基黄酮，它是hcnt3特异性的，IC(50)为0.57+/-0.20 microM，比标准的CNT抑制剂phloridzin (IC(50)为25+/-3.5 microM)强40倍以上。SAR(构效关系)表明，在黄酮和异黄酮的7位和8位都存在羟基取代基，因此对所有3个hCNTs都具有很高的效力。CoMFA(比较分子场分析)和CoMSIA(比较分子相似性指数分析)3 d-qsar(三维定量结构活性关系)建模表明，静电和疏水性能最具影响力之间的交互类黄酮和hCNT1，而静电、疏水性和氢键供体属性是交互与hCNT2 hCNT3占主导地位。3D-QSAR结果还提示类黄酮和核苷的氢键相互作用可能存在共性，提示这两类化合物的hcnt结合位点存在相似性。我们报道了迄今为止最有效和选择性的非核苷类CNT抑制剂;可以作为研究工具和/或进一步开发抑制剂的先导物。
可见酶法酰化是进行基团保护、获取更高药效的核苷类化合物的一种有效方法。
1.5 非水介质中的酶催化1.5.1 非水相酶催化的特点
从土壤中分离出一种产脂肪酶的有效细菌，鉴定为假单胞菌，合成了脂肪酶。通过紫外(UV)和亚硝基胍(NTG)处理，获得了脂肪酶产量提高3.25倍的突变体。发酵条件优化为脂肪酶产率为87.5 U/ml。在pH为9.0和45℃时，脂肪酶活性最高，pH为7.0 ~ 11.0，pH为60℃时，脂肪酶活性稳定，金属离子、表面活性剂和胆盐对脂肪酶活性的影响也进行了研究。脂肪酶是1,3特异性的。在有机溶剂中，脂肪酶的热稳定性显著提高，最佳温度也略有升高。最佳水活度介于0.5和0.6之间。脂肪酶成功应用于有机相催化棕榈油甘油酯水解生产单甘酯(MG)，并对映选择性酯化(R,S)-2-辛醇。脂酶的对映体选择性可通过两亲作用得到显著提高[54, 55]。
枯草素和胰凝乳蛋白酶在各种干燥的有机溶剂中起着催化剂的作用。有机溶剂中酶的转酯化反应遵循Michaelis-Menten动力学，V/Km值与溶剂的疏水性基本相关。胰凝乳蛋白酶和枯草素在有机溶剂中催化所需的水比在其表面形成单分子层所需的水要少得多。胰凝乳蛋白酶在各种有机溶剂中催化活性的巨大差异，部分是由于更亲水的溶剂从酶中去除必需的水，部分是由于溶剂直接影响酶的过程[56-58]。在辛烷的酯交换反应中，胰凝乳蛋白酶和枯草素的速率提高约为1000亿倍;通过位点特异性试剂对酶活性中心进行共价修饰，使酶在有机溶剂中失去催化活性。当辛烷作为反应介质取代水时，胰凝乳蛋白酶对竞争性抑制剂的专一性发生逆转。与水相比，胰凝乳蛋白酶在非水溶剂中的热稳定性和贮存稳定性均有显著提高。有机溶剂中的酶催化现象似乎是由于有机溶剂中蛋白质的结构刚性导致的高动力学障碍，阻止了天然构象的展开[59, 60]。
1.5.2 非水相酶催化的反应体系
用于酶催化的非水介质包括纯有机溶剂体系（Neat organic solvents）、无溶剂体系（Solvent free system）、水-有机溶剂两相体系（Biphasicaqueous-organicsolution）、水不互溶有机溶剂体系（monophasicorganicsolution）、反相胶束体系（Reversemicelles）、水互溶有机溶剂体系（Monophasicaqueous-organic solution）超临界流体（Supercritical fluids）、气体（Gases）等，近年来一些新颖的反应介质例如离子液体（Ionic liquids，ILs）等也相继出现，其中离子液体凭借其“绿色”、稳定性高等特点日益受到人们的青睐。
1.5.3 有机溶剂对非水相酶催化的影响
影响不同的甘油、N、N-二甲基甲酰胺(DMF)和水混合封装在1,4-bis-2-乙基己基磺基琥珀酸(AOT) /正庚烷反向胶束(RMs) 2-萘基乙酸酯的酶法水解α-胰凝乳蛋白酶。在与DMF和质子溶剂混合的情况下，使用吸收、发射和动态光散射技术，已经表明溶剂在RMs的极性核心内被分离。质子溶剂固定在AOT上，而DMF固定在聚合体的极核上。因此，DMF不仅有助于水溶性疏水性底物，增加其有效浓度，但令人惊讶的是，它不影响酶的活性。为了获得可靠的结论，必须保证均方根的存在、极性溶剂的包封以及通过底物分区进行校正。此外，为了约束环境对均质介质中溶剂-溶剂相互作用的影响及其对RMs用作纳米反应器的影响。
采用分光光度法测定了甘油(GY)-水(38% v/v)混合物/双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠(AOT)/正庚烷形成的反胶束溶液中2-萘乙酸(2-NA)在α-胰凝乳蛋白酶(α- ct)催化下的水解动力学。为了比较该反应与在以水为核心的胶束以及相应的均相介质中观察到的反应效率，研究了该反应在水/AOT/正庚烷反胶束溶液中以及在两种均相介质(水和基-水，38% v/v混合物)中的反应。在每种介质中，alpha-CT均通过其色氨酸残基的吸收光谱、发射光谱、荧光寿命和荧光各向异性进行表征。确定了内极性溶剂与表面活性剂摩尔比一定时，AOT浓度对胶束体系动力学参数的影响。此外，所获得的数据可用于评价有机和胶束假相之间的2-NA分配常数。结果表明，在胶束内部加入GY可提高- ct的催化性能。不同介质的荧光各向异性研究表明，与水体系相比，GY的加入增加了体系的粘度。结果表明，反向胶束聚集物中GY的加入降低了α- ct的构象迁移率，提高了酶的稳定性和活性。
脂肪酶可以根据其来源分类，分为微生物脂肪酶、动物脂肪酶和植物脂肪酶。脂肪酶可以很容易地从微生物真菌（如南极洲假丝酵母）或细菌（如荧光假单胞菌）中通过发酵过程高产量地生产出来，其过程缺乏基本的净化步骤。一些脂肪酶表现出对底物的位置专一性，而另一些则不然。对不同来源的游离脂肪酶类型的比较研究表明，荧光P.脂肪酶具有最高的酶活性。通常，来自真菌来源的脂肪酶比来自细菌来源的脂肪酶表现出更好的甘油三酯酯交换活性。
作为一种多功能生物催化剂，脂肪酶具有其他酶蛋白无法比拟的优点[15]：1、在有机溶剂中具有良好的稳定性；2、催化过程不需要辅助因子，一般不发生副反应；3、可以催化水解，酯化，酯交换等众多反应[16]；4、具有独特的化学选择性、区域选择性及立体选择性；5、底物谱广，可催化非天然底物进行反应。与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶生产周期短，分离纯化相对简单，并可利用基因工程和蛋白质工程等技术实现酶的改造并构建生产工程菌[17]，适合工业化生产与应用。1994年，丹麦Novozymes公司首次应用基因工程菌生产来源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶Lipolase，此后许多来源于微生物的脂肪酶也实现了商业化生产[18]。脂肪酶的应用领域日益扩大，被广泛运用于生物柴油、食品加工、面粉改良、造纸造酒、有机合成等化工领域[19]。
1.2.2 脂肪酶的结构及催化机制
脂肪酶是一类重要的水解酶，催化三酰甘油酯中酯键的裂解，具有广泛的生物技术应用价值。脂肪酶是在人体内正确分配和利用油脂所必需的酶。脂蛋白脂肪酶(LPL)在毛细血管中很活跃，它通过水解包装脂蛋白中的甘油三酯，在防止血脂异常方面起着至关重要的作用。30年前，有人提出了一种不活泼的LPL低聚物的存在。M., TusharRanjan (2020)指出天然油中高浓度的omega- 3脂肪酸(ɷ-3 FAs)对于维持身体健康非常重要。脂肪酶是一种很有前途的富集催化剂，但脂肪酶的脂肪酸特异性较差。
在脂肪酶催化酯键水解的过程中，活性酶的构象和四面体跃迁态的稳定都是至关重要的。利用蛋白酶定点突变实验的x射线结构数据和结果已被用作预测可能在脂肪酶中起关键作用的氨基酸残基的基础。克隆了根霉脂肪酶基因，并在大肠杆菌中表达。该基因的定点突变被用来测试计算机辅助预测特定氨基酸在该酶中的功能作用的有效性。通过对米根霉脂肪酶变异体的动力学常数的检测，我们可以识别出直接参与催化反应或稳定酶活性几何结构的氨基酸残基。这些结果与分子力学模拟相结合，基于同源衍生的结构模型，提供了关于结构-功能关系的新信息。对数据的解释与其他水解酶(如蛋白酶)的结果一致。
1.3 固定化酶1.3.1 固定化酶的意义
固定化酶是相对于游离酶而言，是指将能自由移动的游离酶限定不能自由活动的过程，常被用于修饰生物酶。固定化酶的主要作用是提高酶的产酶率和操作稳定性，同时促进酶的再利用。因此，作为生化催化剂，固定化酶相比游离酶有着先天的优势，其反应过程更简单、更容易操作、可多次使用、成本相对低廉、催化速度更快、不易污染、更易于从反应混合物中分离而不污染产物等。
1.3.2 固定化酶的制备方法
酶固定化方法大体上可以分为物理法和化学法，其中物理法包括吸附法、包埋法；其余比如交联法、结合法、离子法属于化学方法。
1.3.2.1物理方法
（1）吸附法
吸附法一般指的是包括离子吸附在内的物理吸附。物理吸附指将酶附着于载体上，它不改变酶的结构，酶的活性几乎不受影响，酶的活性保持较好。但也有缺点，就是酶与其载体连接性不够好，容易分离，而且吸附后产生酶的活性不够高。
离子吸附属于特殊的物理吸附，其载体是特殊的水不溶性载体，和普通的物理吸附一样，活性几乎不受影响和弱化，产生的固定化酶活性，相比普通的物理吸附更高。
（2）包埋法
包埋法也是一种物理法，其不改变酶的分子结构，就是将酶包埋在孔状载体中使其固定化的过程。包埋系统条件要求较低，包埋法适用范围较广，不发生化学反应，酶的活性和稳定性保持较好。包埋法常用于污水处理，如果要用于食品、药品生产催化，对包埋材料的无毒无害性有严格要求。
1.3.2.1化学方法
（1）交联法
交联法是一种化学固定化酶的方法，采用交联试剂将酶内部分子、酶分子与载体分子、酶分子与惰性蛋白分子发生化学反应，形成共价键。该方法可以使包括酶在内的交联物分子结构变得更复杂，提升酶的活性和稳定性。但由于交联剂价格一般很昂贵、采用此方法成本太高，所以一般不单独使用，常结合其他方法，比如吸附或包埋法，既固化酶，又提高酶的活力。
（2）结合法
结合法无论是采用离子键还是共价键进行结合，都改变分子结构，属于化学方法。离子键结合法顾名思义采用的载体是离子交换剂，该方法操作简易、酶的活性保持较好，但是酶与载体结合不紧密，当外部环境发生变化时，容易发生分离。共价键结合法相比离子键结合法，恰好相反，操作复杂、对载体要求较高，但酶与载体结合紧密，酶不易与载体分离，使用时间相比离子键结合法能长很多。
1.3.3 新型固定化酶技术
开发新一代固定化酶，应充分利用快速发展的遗传技术、有机化学、计算化学和生物信息学、反应器和反应设计等科学技术。为了提高酶的产量，无论是独立的或作为催化级联过程，工业生物催化剂必须考虑酶的多种生物转化，从而提高成本效益。
新型固定化酶的大规模生产进展缓慢，这与它们较高的成本和储存问题有关。科学家和工业生产者需要加强合作，促使固定化酶的新矩阵和交叉连接物就可以更好地适应不同的化学过程。因此，深入了解如何实现高功能酶固定化方案非常有必要。在合适的底物支持下，需考虑到交叉连接和预先的应用等固定化生物催化剂。为了实现工业水平的绿色酶过程，需要为研究稳定酶的可用性以及酶的固定-稳定和再活化开发出有效的策略[29-31]。
1.3.3.1基于新型固定化载体的固定化酶技术
（1）金属有机框架固定化酶
金属有机框架（Metal-Organic Frameworks, MOF）是一种新型的固定化酶的材料[32]。该材料由于其多孔隙、比表面积相对较大、孔径可收放、金属位点开放等特征，近年来被广泛用于固定化酶，具体技术可分为物理吸附、化学连接和牢笼包埋[33]。
传统的固定化酶系统由于缺乏对酶的定位、底物和产物的扩散、酶和辅酶的可及性等方面的最优空间控制，难以实现高效的无细胞酶系统。Li（2018）提出一个策略来扩大以锌为本底的金属有机框架（mof）（称为 NU-100 x, x = 3, 4, 5, 6, 7）的孔隙孔径（从3.3到6.7海里）。通过维护扭转角度的精确控制与连接器，来实现与不同孔径的孔隙进行关联。为了验证，使用扩展的NU-100x MOF结构来封装乳酸脱氢酶（LDH），并演示在无细胞生物合成催化系统中使用捕获的蛋白质。值得注意的是，固定化于MOF大孔中的LDH可被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶（NAD和NADH）利用，允许原位辅酶再生，使LDH的活性高于游离酶。
（2）新型纳米材料载体固定化酶
随着纳米科学和技术的迅速突破，且纳米材料由于其拥有极大的比表面积和良好的载荷性，常被用来固定化酶。
尽管作为蛋白质分析的黄金标准，经典的酶联免疫吸附试验(ELISA)目前受到越来越多的敏感性和简洁性需求的挑战。针对当前的需求，纳米材料的最新进展为提高酶联免疫吸附试验的性能和扩大其适用性提供了许多有希望的工具。介绍了纳米材料支持的策略，在不显著改变传统ELISA格式的情况下，显著提高了分析性能。将特别关注纳米材料作为酶联免疫吸附试验中新型读出系统的功能作用，包括作为基质替代品、酶替代品和非酶信号放大器的作用。
纳米粒子已广泛应用于多种酶的固定化。然而，酶在NPs上的稳定是一个主要的挑战，对调节酶的活性及其在医学上的应用至关重要。为了克服这些挑战，有必要探索酶是如何附着在纳米材料上的，以及酶的性质如何受到这些相互作用的影响。Sharifi M.（2020）指出固定化酶进入NPs的不同策略及其相应的抗温度和ph的稳定性，总结了表面电荷、颗粒大小、形态和聚集等因素对固定化酶稳定性的影响。综述了固定化酶在NPs中的活性，揭示了生物分子与NPs相互作用的更多细节。
c. 磁性材料载体固定化酶
磁性材料利用其特有的磁性，改变分子粒子运动轨迹，从而实现固定化酶的目的。胰凝乳蛋白酶已被固定在几种非多孔磁性材料上。镍颗粒被认为是最合适的磁性固定化酶载体。固定化在无孔磁性载体上的胰凝乳蛋白酶未被全脂牛奶或澄清酵母匀浆严重污染。这两种物质都迅速污染了AE -纤维素-胰凝乳蛋白酶，而固定化到丙烯酸基离子交换器中的胰凝乳蛋白酶则缓慢地被污染。无孔岩石磁性颗粒的固定化酶活性与颗粒直径成反比。采用吸附固定和戊二醛交联的方法在颗粒上制备适量的胰凝乳蛋白酶。酯水解活性随酶负荷的增加而增加，而酪蛋白水解活性不增加。胰凝乳蛋白酶被来自磁性载体的金属离子抑制。它的部分保护是使用一个初步的蛋白质涂层，并可能被重新激活与EDTA或BSA孵化[40]。
Lei等[41]制备了含有羧基的磁性纳米微球，经氯化亚砜活化，使木瓜蛋白酶与载体的氯酰基团结合。固定化的木瓜蛋白酶相比于游离酶稳定性提高，并可重复使用。Alpay等[42]利用乳液聚合技术合成了磁性纳米颗粒，使用活性蓝(F3GA)对纳米颗粒进行改性，发现在pH为7.0时对木瓜蛋白酶达到最大吸附量，得到的固定化酶表现出良好的pH和温度稳定性。Cao等[43]使用涂有金纳米层的Fe3O4固定木瓜蛋白酶，Fe3O4纳米磁性颗粒系统与游离酶相比具有更高的催化活性和酶解效率，制备的Fe3O4作为固定化酶的载体性能优于常规的固定化载体，并且使用硼氢化钠可以除去该系统表面的失活酶，从而恢复固定酶的活力。Jiang等[44]制备了磁性壳聚糖微球，并通过吸附和交联两种作用相结合对漆酶进行了固定，固定后漆酶的热稳定性和贮存稳定性大大提高。
1.4 核苷类化合物及核苷酯类衍生物1.4.1 概述
核苷类化合物是一种非常重要的多羟基化合物，在临床医药[45]和功能性高分子材料等领域具有重要的应用价值。核苷类药物是临床上用于抗癌以及治疗病毒类疾病的主要药物，在抗病毒的药物中，核苷类化合物占半数以上，一直都受到广泛关注。6-巯基嘌呤和6-巯基鸟嘌呤是最早应用于抗肿瘤治疗的嘌呤核苷类似物；脱氧核苷类药物，Fludarabine主要应用于慢性淋巴细胞白血病的治疗，Cladribine主要应用于非霍金淋巴瘤的治疗；阿糖胞苷是用于治疗急性骨髓性白血病的脱氧胞嘧啶核苷类似物；氟嘧啶尿苷中的2'-脱氧-5-氟尿嘧啶核苷（Floxuridine, FUdR）对胰腺癌、胸腺癌、结肠癌都有很好的治疗效果，5'-脱氧-5-氟尿嘧啶核苷（Dloxuridine, DFUR）是用于治疗胃癌、结肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、乳腺癌的药物。
然而在临床应用中，核苷类药物也存在着自己的缺陷和不足，比如毒副作用大、口服生物利用率低等问题，因此对核苷类化合物进行结构修饰是核苷类药物研究的一个重要方向。众多研究表明，核苷酯类衍生物具有比原药更高的抗病毒和抗肿瘤活性，抗癌和抗病毒谱更广，同时口服生物利用度也得到了一定的改善，并延长了作用时间。例如泛昔洛韦是阿昔洛韦L-缬氨酰酯，经过结构修饰后改善了阿昔洛韦在口服给药时吸收不良的缺点，用药后能够在肠道内更好低吸收，通过酶的水解后可以完全转变为无环鸟苷，增加了无环鸟苷的生物利用度[49]。泰诺福韦的氨基酸酰胺衍生物的抗HIV活性和抗病毒活性都较原药明显提高。
1.4.2 核苷类化合物的结构修饰
由于核苷类化合物的结构通常含有多个官能团，在核苷及其类似物的合成制备当中，对特定的结构进行保护是能避免副反应发生的有效途径。然而核苷的糖基上羟基众多，利用化学法直接酰化会有反应选择性差，目的产物产率低且分离困难等问题，且对环境不友好。
Wang C（2010） 研究表明，与主要的平衡核苷转运蛋白不同，集中核苷转运蛋白(CNTs)缺乏有效的特异性抑制剂。该研究新建立的稳定表达hCNT1或hCNT2的PK15NTD转染细胞中，并在之前建立的PK15NTD/hCNT3细胞中，苯并吡喃酮衍生物及其相关化合物与人类(h) CNTs的相互作用。黄酮类化合物对hCNT2和hCNT3的抑制活性最高，而对hCNT1的选择性最强的抑制剂是香豆素衍生物。hCNT3是对查耳酮类药物表现出中等敏感性的唯一转运蛋白。最有效的化合物是6-羟基-7-甲氧基黄酮，它是hcnt3特异性的，IC(50)为0.57+/-0.20 microM，比标准的CNT抑制剂phloridzin (IC(50)为25+/-3.5 microM)强40倍以上。SAR(构效关系)表明，在黄酮和异黄酮的7位和8位都存在羟基取代基，因此对所有3个hCNTs都具有很高的效力。CoMFA(比较分子场分析)和CoMSIA(比较分子相似性指数分析)3 d-qsar(三维定量结构活性关系)建模表明，静电和疏水性能最具影响力之间的交互类黄酮和hCNT1，而静电、疏水性和氢键供体属性是交互与hCNT2 hCNT3占主导地位。3D-QSAR结果还提示类黄酮和核苷的氢键相互作用可能存在共性，提示这两类化合物的hcnt结合位点存在相似性。我们报道了迄今为止最有效和选择性的非核苷类CNT抑制剂;可以作为研究工具和/或进一步开发抑制剂的先导物。
可见酶法酰化是进行基团保护、获取更高药效的核苷类化合物的一种有效方法。
1.5 非水介质中的酶催化1.5.1 非水相酶催化的特点
从土壤中分离出一种产脂肪酶的有效细菌，鉴定为假单胞菌，合成了脂肪酶。通过紫外(UV)和亚硝基胍(NTG)处理，获得了脂肪酶产量提高3.25倍的突变体。发酵条件优化为脂肪酶产率为87.5 U/ml。在pH为9.0和45℃时，脂肪酶活性最高，pH为7.0 ~ 11.0，pH为60℃时，脂肪酶活性稳定，金属离子、表面活性剂和胆盐对脂肪酶活性的影响也进行了研究。脂肪酶是1,3特异性的。在有机溶剂中，脂肪酶的热稳定性显著提高，最佳温度也略有升高。最佳水活度介于0.5和0.6之间。脂肪酶成功应用于有机相催化棕榈油甘油酯水解生产单甘酯(MG)，并对映选择性酯化(R,S)-2-辛醇。脂酶的对映体选择性可通过两亲作用得到显著提高[54, 55]。
枯草素和胰凝乳蛋白酶在各种干燥的有机溶剂中起着催化剂的作用。有机溶剂中酶的转酯化反应遵循Michaelis-Menten动力学，V/Km值与溶剂的疏水性基本相关。胰凝乳蛋白酶和枯草素在有机溶剂中催化所需的水比在其表面形成单分子层所需的水要少得多。胰凝乳蛋白酶在各种有机溶剂中催化活性的巨大差异，部分是由于更亲水的溶剂从酶中去除必需的水，部分是由于溶剂直接影响酶的过程[56-58]。在辛烷的酯交换反应中，胰凝乳蛋白酶和枯草素的速率提高约为1000亿倍;通过位点特异性试剂对酶活性中心进行共价修饰，使酶在有机溶剂中失去催化活性。当辛烷作为反应介质取代水时，胰凝乳蛋白酶对竞争性抑制剂的专一性发生逆转。与水相比，胰凝乳蛋白酶在非水溶剂中的热稳定性和贮存稳定性均有显著提高。有机溶剂中的酶催化现象似乎是由于有机溶剂中蛋白质的结构刚性导致的高动力学障碍，阻止了天然构象的展开[59, 60]。
1.5.2 非水相酶催化的反应体系
用于酶催化的非水介质包括纯有机溶剂体系（Neat organic solvents）、无溶剂体系（Solvent free system）、水-有机溶剂两相体系（Biphasicaqueous-organicsolution）、水不互溶有机溶剂体系（monophasicorganicsolution）、反相胶束体系（Reversemicelles）、水互溶有机溶剂体系（Monophasicaqueous-organic solution）超临界流体（Supercritical fluids）、气体（Gases）等，近年来一些新颖的反应介质例如离子液体（Ionic liquids，ILs）等也相继出现，其中离子液体凭借其“绿色”、稳定性高等特点日益受到人们的青睐。
1.5.3 有机溶剂对非水相酶催化的影响
影响不同的甘油、N、N-二甲基甲酰胺(DMF)和水混合封装在1,4-bis-2-乙基己基磺基琥珀酸(AOT) /正庚烷反向胶束(RMs) 2-萘基乙酸酯的酶法水解α-胰凝乳蛋白酶。在与DMF和质子溶剂混合的情况下，使用吸收、发射和动态光散射技术，已经表明溶剂在RMs的极性核心内被分离。质子溶剂固定在AOT上，而DMF固定在聚合体的极核上。因此，DMF不仅有助于水溶性疏水性底物，增加其有效浓度，但令人惊讶的是，它不影响酶的活性。为了获得可靠的结论，必须保证均方根的存在、极性溶剂的包封以及通过底物分区进行校正。此外，为了约束环境对均质介质中溶剂-溶剂相互作用的影响及其对RMs用作纳米反应器的影响。
采用分光光度法测定了甘油(GY)-水(38% v/v)混合物/双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠(AOT)/正庚烷形成的反胶束溶液中2-萘乙酸(2-NA)在α-胰凝乳蛋白酶(α- ct)催化下的水解动力学。为了比较该反应与在以水为核心的胶束以及相应的均相介质中观察到的反应效率，研究了该反应在水/AOT/正庚烷反胶束溶液中以及在两种均相介质(水和基-水，38% v/v混合物)中的反应。在每种介质中，alpha-CT均通过其色氨酸残基的吸收光谱、发射光谱、荧光寿命和荧光各向异性进行表征。确定了内极性溶剂与表面活性剂摩尔比一定时，AOT浓度对胶束体系动力学参数的影响。此外，所获得的数据可用于评价有机和胶束假相之间的2-NA分配常数。结果表明，在胶束内部加入GY可提高- ct的催化性能。不同介质的荧光各向异性研究表明，与水体系相比，GY的加入增加了体系的粘度。结果表明，反向胶束聚集物中GY的加入降低了α- ct的构象迁移率，提高了酶的稳定性和活性。
