相信每一个接触过分子生物学实验的小伙伴，对于浓度测定这个实验都不会陌生。而现在经常出现在实验室中的浓度测定方法就是各种紫外吸收法相关仪器（eg：NanoDrop、OneDrop）等。当我们需要对得到的核酸进行浓度测定时，只需滴加1-2 µl的样品，按一下按钮，利用核酸的紫外吸收特性，即可得到浓度数据。整个浓度测定的过程可谓是十分简单方便的，但是有时我们得到的结果中却透露出一丝丝的“诡异”。
不知大家是否遇到过这样的情况呢？
1.DNA浓度测定结果很高，琼脂糖凝胶检测主条带却很弱，甚至整个条带都呈梯度弥散状，偶尔还会有蛋白堵胶孔或者RNA残留的现象；
2.RNA浓度测定结果很高，逆转后以cDNA为模板进行扩增却没有产物；琼脂糖检测发现RNA条带弥散甚至没有条带；
我们都知道，核酸包括DNA和RNA，均由核糖、磷酸基团以及碱基构成。其中，由于碱基含有芳香环结构，因此具有紫外吸收的特性。核酸的特征吸收波长为260 nm(纯dsDNA：A260=1相当于50 ng/µl；纯ssDNA：A260=1相当于33 ng/µl；纯RNA：A260=1相当于40ng/µl[1])。根据朗伯比尔定律，已知物质的消光系数，液层的厚度，就能利用其吸光度来计算出物质的浓度[2][3]。与此同时，280 nm处可检测蛋白质等；230 nm处可检测盐离子、去污剂、苯酚、乙醇、糖类等，所以还能通过计算A260/A280和A260/A230的数值，估计核酸的纯度(纯DNA:A260/280≈1.7-1.9;A260/A230≈2.0-2.2；纯RNA：A260/280≈2.0;A260/A230≈2.0-2.2)。
图片来源于网络（侵删）
这里要敲黑板啦！
01 紫外吸收法无法区分DNA和RNA
260 nm处可检测dsDNA、ssDNA、RNA、dNTPs等，因此，无论大家本意想测哪个，均会高估其真实浓度。
02 紫外吸收法对溶液的pH和盐酸浓度敏感
280 nm处可检测蛋白质等；230 nm处可检测盐离子、去污剂、苯酚、乙醇、糖类等。但是吸光度本身会受到离子强度以及pH这两个因素的影响[4]。
如图所示，作者Karol Mackey做了这样一组实验，将Na2HPO4溶液（0.1–10.0 mM）用作缓冲液，用于紫外吸收法测定RNA浓度。Na2HPO4溶液的最终pH值如图所示。我们可以看到，RNA A260/280比值随pH和Na2HPO4浓度的增加而增加，在pH值6.0-7.6和Na2HPO4浓度为0.01-0.2 mM之间时，比值增长最快。在Na2HPO4浓度为0-0.5 mM范围内时，未检测到A260的显著差异。但是，高于1 mM的缓冲液浓度会使吸光度小幅下降（4％–12％）。相反，随着Na2HPO4浓度的增加，280 nm吸光度显著降低。这些结果表明，A260/280的增加主要是由于280 nm处吸光度的pH依赖性降低。
03 紫外吸收法对降解比较严重的核酸无能为力
这一点是由紫外吸收原理的局限性所决定的。紫外吸收测定的对象是碱基，因此无论核酸是完整成链的，还是降解成单个游离核苷酸，该方法均无法加以区分。尽管我们可以通过A260/A280数值是否过大来估计核酸样品的降解状况，但却无法选择性地只测定那些结构完整的核酸的浓度。
所以我们会发现，紫外吸收法测定核酸无法区分DNA/RNA，也无法准确测定降解样本，且易受杂质干扰，测定浓度值需结合胶图来判定。
那么我们来看一组数据，分别用Vazyme快速纯化血液/细胞/组织/细菌基因组DNA提取试剂盒和市售试剂盒Q同时提取人的293细胞、仓鼠CHO-K1细胞及革兰氏阳性球菌（275菌）。
表一.OneDrop浓度测定结果
注：a.纯化前产物OneDrop检测结果；b.293细胞和CHO-K1产物用RNaseA 37℃孵育 15 min；275菌DNA产物用Proteinase K 55℃消化10 min；磁珠纯化后，再进行OneDrop检测；
图一.提取基因组产物1%琼脂糖凝胶电泳图
注：a.纯化前产物1%琼脂糖凝胶检测；b.293细胞和CHO-K1产物用RNaseA 37℃孵育 15 min；275菌DNA产物用Proteinase K 55℃消化10 min；再进行磁珠纯化；
可以看出，纯化前产物OneDrop浓度测定结果会受到RNA残留和蛋白残留的影响，会导致测定值虚高。
因此，小V想要再次强调一下，紫外吸收法无法区分DNA和RNA，也无法准确测定降解样本，并且对溶液的pH和盐浓度敏感。为了确保大家下游实验投入量的准确性，可以将提取产物浓度测定结果与胶图结合来看，千万不要被表象所迷惑哦！如果发现提取的DNA中存在RNA残留，可以像小V一样，使用适量的RNaseA 37℃孵育15 min，用磁珠进行纯化后再用紫外吸收法仪器进行测定；如果产物存在蛋白残留，那么可以使用适量的Proteinase K 55℃消化10 min，进行磁珠纯化后再用紫外吸收法仪器进行测定；但是如果不幸发现产物降解的话，小V只能建议重新进行提取了！
最后，如果屏幕前的你对于核酸浓度测定还有什么问题或见解，不妨动动手指在下方的评论区留言哦，小V期待与您相遇。
—END—
1. Desjardins P R , Conklin D S . Microvolume quantitation of nucleic acids.[J]. Journal of Visualized Experiments Jove, 2010, appendix 3(45):A.3J.1-A.3J.16.
2. Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., & Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. Implen Applications Note, Munich, Germany. (2006).
3. Joseph S, David R. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000: 2059-2065
4. Wilfinger, W.W., Mackey, K., & Chomczynski, P. Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity. BioTechniques. 22, 474 - 481 (1997).
不知大家是否遇到过这样的情况呢？
1.DNA浓度测定结果很高，琼脂糖凝胶检测主条带却很弱，甚至整个条带都呈梯度弥散状，偶尔还会有蛋白堵胶孔或者RNA残留的现象；
2.RNA浓度测定结果很高，逆转后以cDNA为模板进行扩增却没有产物；琼脂糖检测发现RNA条带弥散甚至没有条带；
我们都知道，核酸包括DNA和RNA，均由核糖、磷酸基团以及碱基构成。其中，由于碱基含有芳香环结构，因此具有紫外吸收的特性。核酸的特征吸收波长为260 nm(纯dsDNA：A260=1相当于50 ng/µl；纯ssDNA：A260=1相当于33 ng/µl；纯RNA：A260=1相当于40ng/µl[1])。根据朗伯比尔定律，已知物质的消光系数，液层的厚度，就能利用其吸光度来计算出物质的浓度[2][3]。与此同时，280 nm处可检测蛋白质等；230 nm处可检测盐离子、去污剂、苯酚、乙醇、糖类等，所以还能通过计算A260/A280和A260/A230的数值，估计核酸的纯度(纯DNA:A260/280≈1.7-1.9;A260/A230≈2.0-2.2；纯RNA：A260/280≈2.0;A260/A230≈2.0-2.2)。
图片来源于网络（侵删）
这里要敲黑板啦！
01 紫外吸收法无法区分DNA和RNA
260 nm处可检测dsDNA、ssDNA、RNA、dNTPs等，因此，无论大家本意想测哪个，均会高估其真实浓度。
02 紫外吸收法对溶液的pH和盐酸浓度敏感
280 nm处可检测蛋白质等；230 nm处可检测盐离子、去污剂、苯酚、乙醇、糖类等。但是吸光度本身会受到离子强度以及pH这两个因素的影响[4]。
如图所示，作者Karol Mackey做了这样一组实验，将Na2HPO4溶液（0.1–10.0 mM）用作缓冲液，用于紫外吸收法测定RNA浓度。Na2HPO4溶液的最终pH值如图所示。我们可以看到，RNA A260/280比值随pH和Na2HPO4浓度的增加而增加，在pH值6.0-7.6和Na2HPO4浓度为0.01-0.2 mM之间时，比值增长最快。在Na2HPO4浓度为0-0.5 mM范围内时，未检测到A260的显著差异。但是，高于1 mM的缓冲液浓度会使吸光度小幅下降（4％–12％）。相反，随着Na2HPO4浓度的增加，280 nm吸光度显著降低。这些结果表明，A260/280的增加主要是由于280 nm处吸光度的pH依赖性降低。
03 紫外吸收法对降解比较严重的核酸无能为力
这一点是由紫外吸收原理的局限性所决定的。紫外吸收测定的对象是碱基，因此无论核酸是完整成链的，还是降解成单个游离核苷酸，该方法均无法加以区分。尽管我们可以通过A260/A280数值是否过大来估计核酸样品的降解状况，但却无法选择性地只测定那些结构完整的核酸的浓度。
所以我们会发现，紫外吸收法测定核酸无法区分DNA/RNA，也无法准确测定降解样本，且易受杂质干扰，测定浓度值需结合胶图来判定。
那么我们来看一组数据，分别用Vazyme快速纯化血液/细胞/组织/细菌基因组DNA提取试剂盒和市售试剂盒Q同时提取人的293细胞、仓鼠CHO-K1细胞及革兰氏阳性球菌（275菌）。
表一.OneDrop浓度测定结果
注：a.纯化前产物OneDrop检测结果；b.293细胞和CHO-K1产物用RNaseA 37℃孵育 15 min；275菌DNA产物用Proteinase K 55℃消化10 min；磁珠纯化后，再进行OneDrop检测；
图一.提取基因组产物1%琼脂糖凝胶电泳图
注：a.纯化前产物1%琼脂糖凝胶检测；b.293细胞和CHO-K1产物用RNaseA 37℃孵育 15 min；275菌DNA产物用Proteinase K 55℃消化10 min；再进行磁珠纯化；
可以看出，纯化前产物OneDrop浓度测定结果会受到RNA残留和蛋白残留的影响，会导致测定值虚高。
因此，小V想要再次强调一下，紫外吸收法无法区分DNA和RNA，也无法准确测定降解样本，并且对溶液的pH和盐浓度敏感。为了确保大家下游实验投入量的准确性，可以将提取产物浓度测定结果与胶图结合来看，千万不要被表象所迷惑哦！如果发现提取的DNA中存在RNA残留，可以像小V一样，使用适量的RNaseA 37℃孵育15 min，用磁珠进行纯化后再用紫外吸收法仪器进行测定；如果产物存在蛋白残留，那么可以使用适量的Proteinase K 55℃消化10 min，进行磁珠纯化后再用紫外吸收法仪器进行测定；但是如果不幸发现产物降解的话，小V只能建议重新进行提取了！
最后，如果屏幕前的你对于核酸浓度测定还有什么问题或见解，不妨动动手指在下方的评论区留言哦，小V期待与您相遇。
—END—
1. Desjardins P R , Conklin D S . Microvolume quantitation of nucleic acids.[J]. Journal of Visualized Experiments Jove, 2010, appendix 3(45):A.3J.1-A.3J.16.
2. Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., & Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. Implen Applications Note, Munich, Germany. (2006).
3. Joseph S, David R. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000: 2059-2065
4. Wilfinger, W.W., Mackey, K., & Chomczynski, P. Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity. BioTechniques. 22, 474 - 481 (1997).
