由南京大学国家生物医药技术重点实验室侯亚义教授团队成员发表的论文《灵芝孢子油对人肝癌细胞株HepG2的影响及其机制的初步研究》刊登于《实用肿瘤杂志》2011年第26卷第2期，试验证实灵芝孢子油可抑制肝癌细胞增殖，诱导肝癌细胞凋亡，并抑制其迁移能力。
以下为论文全文
肝癌是世界上死亡率第三的癌症。肝炎病毒的感染,加上饮食上接触致癌原,都增加了发病率[1]。肿瘤的发生、发展,与细胞凋亡与细胞增殖之间的失衡、细胞的迁移有着密切关系。与此同时,肿瘤细胞表面Toll样受体的表达也参与到肿瘤细胞逃逸免疫监视等过程中。
灵芝被称为“仙草”,是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝和紫芝的总称。随着对灵芝研究的不断深入,灵芝的生殖细胞——孢子的药用价值也引起了人们的关注。灵芝孢子油由灵芝孢子粉经CO2超临界萃取而来[2],是一种脂溶性物质,主要成分为三萜类、甾醇类、脂肪及脂肪酸等[3]。已有研究表明,灵芝孢子油不仅能抑制肿瘤生长 、杀伤肿瘤细胞[4],还对免疫功能有一定的调节作用[5]。
本实验以HepG2人肝癌细胞为靶细胞,对灵芝孢子油对肝癌细胞的影响及其机制进行初步研究。
01
材料与方法
1.1 材料
HepG2人肝癌细胞引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库;灵芝孢子油由南京中科药业有限公司馈赠,纯度>99%;RPMI1640培养基干粉、胰蛋白酶均购自Gibco公司;新生小牛血清购自PAA公司;CCK-8试剂盒购自同仁化学研究所;AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒购自 Sigma-Aldrich;鬼笔环肽Phalloidin-PE购自Sigma公司;明胶干粉购于Amresco公司;引物由上海Invitrogen合成;顺铂注射液(6mL,30mg)购自江苏豪森药业有限公司(国药准字H20040813)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
人肝癌HepG2细胞,用完全RPMI-1640培养基(含10%灭活小牛血清、100mg/L青霉素及100mg/L链霉素)培养,置于37℃、5%CO2培养箱中,传代培养至对数生长期备用。
1.2.2 CCK8法检测灵芝孢子油对HepG2细胞的增殖抑制作用
取对数生长期HepG2细胞制成1×104/mL单细胞悬液,接种于96孔板中,每孔100μL,37℃、5%CO2条件下培养24小时。经不同浓度的灵芝孢子油(0、0.1、0.25、0.5、1g/L)分别处理24、48小时后,加入CCK8试剂10μL,继续孵育4小时后,用酶标仪450nm处测各孔的吸收度(OD值)。每次每组测定6个复孔。以培养液作为空白对照并调零,测3次,取平均值。根据公式计算细胞增殖抑制率:细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。
1.2.3 体外运动迁移实验
6孔培养板内接种1×105个HepG2细胞,37℃、5%CO2条件下培养至细胞覆盖率为85%左右,用灭菌双面剃须刀片在培养孔中刮制2条整齐而平行的无细胞区。给予不同浓度的灵芝孢子油(0、0.1、0.25、0.5 g/L)和顺铂注射液(10mg/L)处理,分别于6、12和24小时后在显微镜下观察比较不同实验组之间细胞迁移情况。
1.2.4 流式细胞仪Annexin V2FITC/PI双染法检测灵芝孢子油对HepG2细胞凋亡的影响
取对数生长期HepG2细胞制成2×105/mL单细胞悬液,接种于24孔培养板中,37℃、5%CO2培养箱中培养24小时后,给予不同浓度的灵芝孢子油(0、0.1、0.25、0.5、1g/L)处理,另外设置空白对照组,继续孵育。培养24小时后用0.25%胰酶收集各组细胞,用冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两遍,然后重悬于100μL binding buffer中,根据Annexin V-FITC染色试剂盒说明书,对细胞进行染色。利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.2.5 RT-PCR技术检测细胞凋亡相关因子VEGF、Bcl-2、Bax及p53 mRNA表达
取对数生长期HepG2细胞制成4×105/mL单细胞悬液,接种于6孔培养板中,37℃、5%CO2培养箱中培养24小时后,给予不同浓度的灵芝孢子油(0、0.1、0.25、0.5、1g/L)和顺铂(10mg/L)处理, 继续孵育。培养6小时后收集各实验组细胞, 用Trizol提取总RNA。用紫外分光光度计测定 RNA纯度(A260/A280>1.6),同时行RNA定量。取1μgRNA进行逆转录合成cDNA, 进行PCR检测细胞凋亡相关因子VEGF、Bcl-2、Bax及p53的表达。引物序列见表1。PCR反应条件为:94℃30秒,Tm退火30秒,72℃延伸45秒,30个循环 , 最后 72℃5分钟;目的基因和内参照进行同管扩增,以减少误差。扩增产物进行12g/L的TBE琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭(EB)染色,在凝胶成像分析系统紫外光下进行拍照和图像分析。以β-actin为内参照,目的基因的PCR产物条带的灰度Volume之比作为反映目的基因mRNA水平的相对指标。
表1 HepG2细胞凋亡相关因子RT-PCR引物序列
1.2.6 RT-PCR技术检测细胞Toll样受体mRNA表达
取对数生长期HepG2细胞制成4×105/mL单细胞悬液,接种于6孔培养板中,37℃、5%CO2培养箱中培养24小时后,给予不同浓度的灵芝孢子油(0、0.1、0.25、0.5、1g/L)和顺铂(10mg/L)处理,继续孵育。培养6小时后收集各实验组细胞,用Trizol提取总RNA。用紫外分光光度计测定RNA纯度(A260/A280>1.6),同时行RNA定量。取1μgRNA进行逆转录合成cDNA,进行PCR检测细胞Toll样受体mRNA的表达。引物序列见表2。PCR反应条件为:94℃30秒,Tm退火30秒,72℃延伸45秒,30个循环,最后72℃5分钟;目的基因和内参照进行同管扩增,以减少误差。扩增产物进行12g/L的TBE琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭(EB)染色,在凝胶成像分析系统紫外光下进行拍照和图像分析。以β-actin为内参照,目的基因的PCR产物条带的灰度Volume之比作为反映目的基因mRNA水平的相对指标。
表2 HepG2细胞Toll样受体RT-PCR引物序列
1.2.7 细胞爬片及免疫荧光标志细胞骨架
将无菌盖玻片放到6孔培养板里,加覆 500μL左右1%的无菌明胶,37℃孵育2小时,吸去明胶,PBS洗涤1次,将对数生长期细胞以适当密度接种于6孔培养板过夜。待细胞贴壁后, 加入不同浓度的灵芝孢子油(0、0.1、0.25、0.5、1g/L)和顺铂注射液 (10mg/L)处理24小时。将细胞爬片用4%多聚甲醛固定30分钟,用PBS洗3次, 0.1%Triton100室温处理15分钟,PBS洗 3次,用3%BSA室温封闭1小时,PBST洗3次,加Phalloidin-PE(1∶50),室温孵育1小时,PBS洗3次,最后DAPI(0.5μg/L)染核 10分钟,PBS洗3次,加甘油封片,用激光共聚焦显微镜观察。
1.3 统计学分析
实验均重复3次或3次以上,实验数据用GraphpadPrism5软件进行分析,实验组与对照组比较采用单因素相关分析。
02
结果
2.1 灵芝孢子油对HepG2细胞增殖的抑制作用
不同浓度的灵芝孢子油作用HepG2细胞24小时和48小时后,HepG2细胞的增殖受到显著抑制,且呈剂量依赖性(见图1、表 3)。
图1 灵芝孢子油对HepG2细胞增殖活力的影响
表3 灵芝孢子油对HepG2细胞增殖的影响
2.2 灵芝孢子油对HepG2细胞迁移能力的影响
体外运动迁移实验表明不同浓度的灵芝孢子油对细胞浸润迁移能力均有一定的抑制作用,且随着灵芝孢子油浓度的递增, 对细胞迁移能力的抑制作用越显著,呈剂量依赖性(见图2)。
图2 不同浓度的灵芝孢子油对HepG2细胞迁移能力的影响
2.3 灵芝孢子油诱导HepG2细胞凋亡的检测
用AnnexinV/PI双标志法流式细胞仪检测不同浓度的灵芝孢子油作用HepG2细胞24小时后,细胞凋亡率升高 ,说明灵芝孢子油能明显诱导了细胞凋亡(见表4)。
表4 不同浓度灵芝孢子油诱导HepG2细胞凋亡的影响
2.4 灵芝孢子油对HepG2细胞凋亡相关因子VEGF、Bcl-2、Bax及p53 mRNA表达水平的影响
在灵芝孢子油的作用下,特别是在其高浓度(0.5g/L和1g/L)时,HepG2细胞中 VEGF、Bax以及Bcl-2在mRNA水平上表达下降,而实验组的p53与对照组比较差异无统计学意义 。其中, 实验组的Bcl-2 /Bax的比值<1, 表明灵芝孢子油有促凋亡作用(见表5、图3)。
表5 不同浓度的灵芝孢子油对HepG2细胞VEGF、Bcl-2、Bax及p53 mRNA表达水平的影响
图3 不同浓度的灵芝孢子油对 HepG2细胞
VEGF、Bcl-2、Bax及p53 mRNA表达水平的影响
2.5 灵芝孢子油对HepG2细胞Toll样受体mRNA表达水平的影响
在较高浓度灵芝孢子油的作用下, HepG2细胞中TLR1和TLR3表达下降,而TLR2、TLR6以及TLR8表达升高,而TLR4、TLR9和TLR10表达无显著变化(见表6、图4)。
表6 不同浓度的灵芝孢子油对HepG2细胞TLRsmRNA表达水平的影响
图4 不同浓度的灵芝孢子油对HepG2细胞
TLRsmRNA表达水平的影响
2.6 免疫荧光染色观察灵芝孢子油诱导 HepG2细胞凋亡
肌动蛋白Phalloidin-PE荧光染色为红色,呈红色细丝状,主要沿细胞长轴分布,贯穿整个HepG2细胞,相对于对照组、实验组的细胞变圆,伪足减少,降低了细胞的运动能力。同时可见,细胞密度降低,细胞骨架遭到破坏。而DAPI在荧光激发下发蓝光,与细胞核DNA结合,染核。对照组细胞的细胞核膜完整,近似圆形,边缘清晰,染色均匀。灵芝孢子油作用后的细胞体积缩小 、变圆,胞核内颗粒增加,其细胞核呈波纹状、折缝样,染色质浓集,高浓度的灵芝孢子油还伴有细胞核固缩或断裂现象及出现凋亡小体,为细胞凋亡的典型特征(图5)。
图5 免疫荧光染色观察灵芝孢子油诱导HepG2细胞凋亡
03
讨论
灵芝作为一种名贵中药,其药用价值已被大量研究分析验证。而在防癌、抗肿瘤方面,由灵芝孢子粉经CO2超临界萃取而来的脂溶性物质——灵芝孢子油的功效是灵芝子实体的60～70倍。已有研究表明,灵芝孢子油能增强小鼠淋巴细胞增殖能力及腹腔巨噬细胞吞噬能力,提高NK细胞杀伤作用等,进而对增强免疫细胞的生理活性,恢复受损机体的免疫功能,达到抗肿瘤的目的[4,6]。
肿瘤的发生与发展,依赖于细胞凋亡和细胞增殖之间的平衡与失衡。 现已知Bcl-2家族基因和p53与细胞凋亡信号转导有着密切关系。Bcl-2家族蛋白功能上分为促凋亡(如Bax和Bad等)和抑凋亡(如Bcl-2和 Bcl-xl等)两类。本研究结果表明,高浓度的灵芝孢子油能够显著抑制HepG2细胞体外 生长,促进HepG2细胞的凋亡进程,并使HepG2细胞出现核质浓集和凋亡小体等典型的凋亡形态学特征。同时,Bax蛋白在基因水平上均有下调,可能由于灵芝孢子油并不在基因水平上对其进行调控;且另据报道,Bax与Bcl-2的比值,对药物诱导的细胞凋亡的发生具有决定性作用[7]。而灵芝孢子油作用后,Bcl-2/Bax的比值<1,表现为促凋亡作用。
另一方面,肿瘤的发生、发展、浸润及转移也与血管新生密切相关[8]。VEGF是血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)家族中的一个亚家族,是参与血管新生和血管发生过程的重要信号蛋白。它是内皮细胞的特异有丝分裂原,能增强内皮细胞的生存能力,促进有丝分裂,增强趋化性和血管渗透性,在体外能促进内皮细胞的生长,在体内可诱导血管发生,是目前已知作用最强的促血管生成的生长因子之一,已成为肿瘤治疗的靶点之一[9]。体外运动迁移实验表明,灵芝孢子油能显著抑制细胞迁移能力,减少细胞伪足,并在基因水平上下调VEGF的表达,进而对肿瘤发展、迁移起到一定的限制作用。
Toll样受体(TLRs)属于模式识别受体,是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁。在人体中已确定13种TLRs,主要表达在免疫细胞和上皮细胞中。近来研究发现,在一些肿瘤细胞系或者肿瘤,特别是上皮衍生性肿瘤上,也可以检测到TLRs[10]。TLRs是可能促进增殖,抑制凋亡,并参与肿瘤细胞的迁移、浸润及血管生成[11]。例如,有研究表明肿瘤细胞TLR3的表达可诱导肿瘤细胞的凋亡[12],而肿瘤细胞TLR8的表达与其天然或合成配体结合可逆转调节性T细胞的免疫抑制作用。本实验从基因水平上验证了TLRs在HepG2细胞上的表达,同时初步证明灵芝孢子油对TLRs表达有一定影响,而具体作用机制已在进一步的研究中。
综上研究结果表明,灵芝孢子油能够调控肝癌细胞凋亡相关基因表达,进而抑制肝癌细胞的体外增殖,促进细胞凋亡。此外, 灵芝孢子油还可以抑制细胞体外迁移,影响肝癌细胞自身TLRs的表达。本研究揭示了灵芝孢子油抗肿瘤作用的部分机制,为灵芝孢子油在肝癌治疗的应用上提供了新的方向。
参考文献
[1]Kensler TW,Qian GS,Chen JG,et al.Translational strategies for cancer prevention in liver[J].Nat Rev Cancer, 2003, 3(5):321 -329.
[2]王彬,周科勤,范青生,等.超临界CO2萃取菌草灵芝孢子油中三萜类物质和脂肪酸的测定[J].食品安全与检测, 2006, 22 (1):74 -75.
[3]林志彬, 王鹏云.灵芝孢子及其活性成分的药理作用[J] .北京大学学报, 2006, 38 (5):541 -547.
[4]Xie YZ, Li SZ, Albert Y, et al Ganoderma lucidum inhibits tumour cell proliferation and induces tumour cell death[J] .Enzyme Microb Tech, 2006, 40(1):177 -185.
[5]刘菊研,刘少勇,金铃,等.口服灵芝孢子油对小鼠免疫功能的影响[J] .中华中医药杂志, 2006, 21(5):300 -301.
[6]高杨, 邓新国, 孙倩娜 , 等.灵芝孢子油对 N-甲基-N-亚硝酸脲诱导的大鼠视网膜损伤中 Caspase23表达的影响[J] .中国药理学通报, 2009, 25(7):871 -875.
[7]Van Delft MF,Huang DC.How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis[J] .Cell Res,2006, 16(2):203 -213.
[8]Jain RK,Di Tomaso E,Duda DG, etal.Angiogenesis in brain tumours[ J] .Nat Rev Neurosci, 2007, 8(8):610-622.
[9]Harper SJ,Bates DO.VEGF-A splicing:the key to anti-angiogenic therapeutics[J].Nat Rev Cancer,2008, 8(11):880 -887.
[10]Yu L,Chen SW.Toll-like receptors expressed in tumor cells:targets for therapy[J] .Cancer Immunol Immun,2008, 57(9):1271 -1278.
[11]Rakoff-Nahoum S,Medzhitov R.Toll-like receptors and cancer[J] .Nat Rev Cancer, 2009, 9(1):57 -63.
[12]Salaun B,Lebecque S,Matikainen S,et al.Toll-like receptor 3 expressed by melanoma cells as a target for therapy[J] .Clin Cancer Res, 2007, 13(15):4565 -4574.
以下为论文全文
肝癌是世界上死亡率第三的癌症。肝炎病毒的感染,加上饮食上接触致癌原,都增加了发病率[1]。肿瘤的发生、发展,与细胞凋亡与细胞增殖之间的失衡、细胞的迁移有着密切关系。与此同时,肿瘤细胞表面Toll样受体的表达也参与到肿瘤细胞逃逸免疫监视等过程中。
灵芝被称为“仙草”,是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝和紫芝的总称。随着对灵芝研究的不断深入,灵芝的生殖细胞——孢子的药用价值也引起了人们的关注。灵芝孢子油由灵芝孢子粉经CO2超临界萃取而来[2],是一种脂溶性物质,主要成分为三萜类、甾醇类、脂肪及脂肪酸等[3]。已有研究表明,灵芝孢子油不仅能抑制肿瘤生长 、杀伤肿瘤细胞[4],还对免疫功能有一定的调节作用[5]。
本实验以HepG2人肝癌细胞为靶细胞,对灵芝孢子油对肝癌细胞的影响及其机制进行初步研究。
01
材料与方法
1.1 材料
HepG2人肝癌细胞引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库;灵芝孢子油由南京中科药业有限公司馈赠,纯度>99%;RPMI1640培养基干粉、胰蛋白酶均购自Gibco公司;新生小牛血清购自PAA公司;CCK-8试剂盒购自同仁化学研究所;AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒购自 Sigma-Aldrich;鬼笔环肽Phalloidin-PE购自Sigma公司;明胶干粉购于Amresco公司;引物由上海Invitrogen合成;顺铂注射液(6mL,30mg)购自江苏豪森药业有限公司(国药准字H20040813)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
人肝癌HepG2细胞,用完全RPMI-1640培养基(含10%灭活小牛血清、100mg/L青霉素及100mg/L链霉素)培养,置于37℃、5%CO2培养箱中,传代培养至对数生长期备用。
1.2.2 CCK8法检测灵芝孢子油对HepG2细胞的增殖抑制作用
取对数生长期HepG2细胞制成1×104/mL单细胞悬液,接种于96孔板中,每孔100μL,37℃、5%CO2条件下培养24小时。经不同浓度的灵芝孢子油(0、0.1、0.25、0.5、1g/L)分别处理24、48小时后,加入CCK8试剂10μL,继续孵育4小时后,用酶标仪450nm处测各孔的吸收度(OD值)。每次每组测定6个复孔。以培养液作为空白对照并调零,测3次,取平均值。根据公式计算细胞增殖抑制率:细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。
1.2.3 体外运动迁移实验
6孔培养板内接种1×105个HepG2细胞,37℃、5%CO2条件下培养至细胞覆盖率为85%左右,用灭菌双面剃须刀片在培养孔中刮制2条整齐而平行的无细胞区。给予不同浓度的灵芝孢子油(0、0.1、0.25、0.5 g/L)和顺铂注射液(10mg/L)处理,分别于6、12和24小时后在显微镜下观察比较不同实验组之间细胞迁移情况。
1.2.4 流式细胞仪Annexin V2FITC/PI双染法检测灵芝孢子油对HepG2细胞凋亡的影响
取对数生长期HepG2细胞制成2×105/mL单细胞悬液,接种于24孔培养板中,37℃、5%CO2培养箱中培养24小时后,给予不同浓度的灵芝孢子油(0、0.1、0.25、0.5、1g/L)处理,另外设置空白对照组,继续孵育。培养24小时后用0.25%胰酶收集各组细胞,用冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两遍,然后重悬于100μL binding buffer中,根据Annexin V-FITC染色试剂盒说明书,对细胞进行染色。利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.2.5 RT-PCR技术检测细胞凋亡相关因子VEGF、Bcl-2、Bax及p53 mRNA表达
取对数生长期HepG2细胞制成4×105/mL单细胞悬液,接种于6孔培养板中,37℃、5%CO2培养箱中培养24小时后,给予不同浓度的灵芝孢子油(0、0.1、0.25、0.5、1g/L)和顺铂(10mg/L)处理, 继续孵育。培养6小时后收集各实验组细胞, 用Trizol提取总RNA。用紫外分光光度计测定 RNA纯度(A260/A280>1.6),同时行RNA定量。取1μgRNA进行逆转录合成cDNA, 进行PCR检测细胞凋亡相关因子VEGF、Bcl-2、Bax及p53的表达。引物序列见表1。PCR反应条件为:94℃30秒,Tm退火30秒,72℃延伸45秒,30个循环 , 最后 72℃5分钟;目的基因和内参照进行同管扩增,以减少误差。扩增产物进行12g/L的TBE琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭(EB)染色,在凝胶成像分析系统紫外光下进行拍照和图像分析。以β-actin为内参照,目的基因的PCR产物条带的灰度Volume之比作为反映目的基因mRNA水平的相对指标。
表1 HepG2细胞凋亡相关因子RT-PCR引物序列
1.2.6 RT-PCR技术检测细胞Toll样受体mRNA表达
取对数生长期HepG2细胞制成4×105/mL单细胞悬液,接种于6孔培养板中,37℃、5%CO2培养箱中培养24小时后,给予不同浓度的灵芝孢子油(0、0.1、0.25、0.5、1g/L)和顺铂(10mg/L)处理,继续孵育。培养6小时后收集各实验组细胞,用Trizol提取总RNA。用紫外分光光度计测定RNA纯度(A260/A280>1.6),同时行RNA定量。取1μgRNA进行逆转录合成cDNA,进行PCR检测细胞Toll样受体mRNA的表达。引物序列见表2。PCR反应条件为:94℃30秒,Tm退火30秒,72℃延伸45秒,30个循环,最后72℃5分钟;目的基因和内参照进行同管扩增,以减少误差。扩增产物进行12g/L的TBE琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭(EB)染色,在凝胶成像分析系统紫外光下进行拍照和图像分析。以β-actin为内参照,目的基因的PCR产物条带的灰度Volume之比作为反映目的基因mRNA水平的相对指标。
表2 HepG2细胞Toll样受体RT-PCR引物序列
1.2.7 细胞爬片及免疫荧光标志细胞骨架
将无菌盖玻片放到6孔培养板里,加覆 500μL左右1%的无菌明胶,37℃孵育2小时,吸去明胶,PBS洗涤1次,将对数生长期细胞以适当密度接种于6孔培养板过夜。待细胞贴壁后, 加入不同浓度的灵芝孢子油(0、0.1、0.25、0.5、1g/L)和顺铂注射液 (10mg/L)处理24小时。将细胞爬片用4%多聚甲醛固定30分钟,用PBS洗3次, 0.1%Triton100室温处理15分钟,PBS洗 3次,用3%BSA室温封闭1小时,PBST洗3次,加Phalloidin-PE(1∶50),室温孵育1小时,PBS洗3次,最后DAPI(0.5μg/L)染核 10分钟,PBS洗3次,加甘油封片,用激光共聚焦显微镜观察。
1.3 统计学分析
实验均重复3次或3次以上,实验数据用GraphpadPrism5软件进行分析,实验组与对照组比较采用单因素相关分析。
02
结果
2.1 灵芝孢子油对HepG2细胞增殖的抑制作用
不同浓度的灵芝孢子油作用HepG2细胞24小时和48小时后,HepG2细胞的增殖受到显著抑制,且呈剂量依赖性(见图1、表 3)。
图1 灵芝孢子油对HepG2细胞增殖活力的影响
表3 灵芝孢子油对HepG2细胞增殖的影响
2.2 灵芝孢子油对HepG2细胞迁移能力的影响
体外运动迁移实验表明不同浓度的灵芝孢子油对细胞浸润迁移能力均有一定的抑制作用,且随着灵芝孢子油浓度的递增, 对细胞迁移能力的抑制作用越显著,呈剂量依赖性(见图2)。
图2 不同浓度的灵芝孢子油对HepG2细胞迁移能力的影响
2.3 灵芝孢子油诱导HepG2细胞凋亡的检测
用AnnexinV/PI双标志法流式细胞仪检测不同浓度的灵芝孢子油作用HepG2细胞24小时后,细胞凋亡率升高 ,说明灵芝孢子油能明显诱导了细胞凋亡(见表4)。
表4 不同浓度灵芝孢子油诱导HepG2细胞凋亡的影响
2.4 灵芝孢子油对HepG2细胞凋亡相关因子VEGF、Bcl-2、Bax及p53 mRNA表达水平的影响
在灵芝孢子油的作用下,特别是在其高浓度(0.5g/L和1g/L)时,HepG2细胞中 VEGF、Bax以及Bcl-2在mRNA水平上表达下降,而实验组的p53与对照组比较差异无统计学意义 。其中, 实验组的Bcl-2 /Bax的比值<1, 表明灵芝孢子油有促凋亡作用(见表5、图3)。
表5 不同浓度的灵芝孢子油对HepG2细胞VEGF、Bcl-2、Bax及p53 mRNA表达水平的影响
图3 不同浓度的灵芝孢子油对 HepG2细胞
VEGF、Bcl-2、Bax及p53 mRNA表达水平的影响
2.5 灵芝孢子油对HepG2细胞Toll样受体mRNA表达水平的影响
在较高浓度灵芝孢子油的作用下, HepG2细胞中TLR1和TLR3表达下降,而TLR2、TLR6以及TLR8表达升高,而TLR4、TLR9和TLR10表达无显著变化(见表6、图4)。
表6 不同浓度的灵芝孢子油对HepG2细胞TLRsmRNA表达水平的影响
图4 不同浓度的灵芝孢子油对HepG2细胞
TLRsmRNA表达水平的影响
2.6 免疫荧光染色观察灵芝孢子油诱导 HepG2细胞凋亡
肌动蛋白Phalloidin-PE荧光染色为红色,呈红色细丝状,主要沿细胞长轴分布,贯穿整个HepG2细胞,相对于对照组、实验组的细胞变圆,伪足减少,降低了细胞的运动能力。同时可见,细胞密度降低,细胞骨架遭到破坏。而DAPI在荧光激发下发蓝光,与细胞核DNA结合,染核。对照组细胞的细胞核膜完整,近似圆形,边缘清晰,染色均匀。灵芝孢子油作用后的细胞体积缩小 、变圆,胞核内颗粒增加,其细胞核呈波纹状、折缝样,染色质浓集,高浓度的灵芝孢子油还伴有细胞核固缩或断裂现象及出现凋亡小体,为细胞凋亡的典型特征(图5)。
图5 免疫荧光染色观察灵芝孢子油诱导HepG2细胞凋亡
03
讨论
灵芝作为一种名贵中药,其药用价值已被大量研究分析验证。而在防癌、抗肿瘤方面,由灵芝孢子粉经CO2超临界萃取而来的脂溶性物质——灵芝孢子油的功效是灵芝子实体的60～70倍。已有研究表明,灵芝孢子油能增强小鼠淋巴细胞增殖能力及腹腔巨噬细胞吞噬能力,提高NK细胞杀伤作用等,进而对增强免疫细胞的生理活性,恢复受损机体的免疫功能,达到抗肿瘤的目的[4,6]。
肿瘤的发生与发展,依赖于细胞凋亡和细胞增殖之间的平衡与失衡。 现已知Bcl-2家族基因和p53与细胞凋亡信号转导有着密切关系。Bcl-2家族蛋白功能上分为促凋亡(如Bax和Bad等)和抑凋亡(如Bcl-2和 Bcl-xl等)两类。本研究结果表明,高浓度的灵芝孢子油能够显著抑制HepG2细胞体外 生长,促进HepG2细胞的凋亡进程,并使HepG2细胞出现核质浓集和凋亡小体等典型的凋亡形态学特征。同时,Bax蛋白在基因水平上均有下调,可能由于灵芝孢子油并不在基因水平上对其进行调控;且另据报道,Bax与Bcl-2的比值,对药物诱导的细胞凋亡的发生具有决定性作用[7]。而灵芝孢子油作用后,Bcl-2/Bax的比值<1,表现为促凋亡作用。
另一方面,肿瘤的发生、发展、浸润及转移也与血管新生密切相关[8]。VEGF是血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)家族中的一个亚家族,是参与血管新生和血管发生过程的重要信号蛋白。它是内皮细胞的特异有丝分裂原,能增强内皮细胞的生存能力,促进有丝分裂,增强趋化性和血管渗透性,在体外能促进内皮细胞的生长,在体内可诱导血管发生,是目前已知作用最强的促血管生成的生长因子之一,已成为肿瘤治疗的靶点之一[9]。体外运动迁移实验表明,灵芝孢子油能显著抑制细胞迁移能力,减少细胞伪足,并在基因水平上下调VEGF的表达,进而对肿瘤发展、迁移起到一定的限制作用。
Toll样受体(TLRs)属于模式识别受体,是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁。在人体中已确定13种TLRs,主要表达在免疫细胞和上皮细胞中。近来研究发现,在一些肿瘤细胞系或者肿瘤,特别是上皮衍生性肿瘤上,也可以检测到TLRs[10]。TLRs是可能促进增殖,抑制凋亡,并参与肿瘤细胞的迁移、浸润及血管生成[11]。例如,有研究表明肿瘤细胞TLR3的表达可诱导肿瘤细胞的凋亡[12],而肿瘤细胞TLR8的表达与其天然或合成配体结合可逆转调节性T细胞的免疫抑制作用。本实验从基因水平上验证了TLRs在HepG2细胞上的表达,同时初步证明灵芝孢子油对TLRs表达有一定影响,而具体作用机制已在进一步的研究中。
综上研究结果表明,灵芝孢子油能够调控肝癌细胞凋亡相关基因表达,进而抑制肝癌细胞的体外增殖,促进细胞凋亡。此外, 灵芝孢子油还可以抑制细胞体外迁移,影响肝癌细胞自身TLRs的表达。本研究揭示了灵芝孢子油抗肿瘤作用的部分机制,为灵芝孢子油在肝癌治疗的应用上提供了新的方向。
参考文献
[1]Kensler TW,Qian GS,Chen JG,et al.Translational strategies for cancer prevention in liver[J].Nat Rev Cancer, 2003, 3(5):321 -329.
[2]王彬,周科勤,范青生,等.超临界CO2萃取菌草灵芝孢子油中三萜类物质和脂肪酸的测定[J].食品安全与检测, 2006, 22 (1):74 -75.
[3]林志彬, 王鹏云.灵芝孢子及其活性成分的药理作用[J] .北京大学学报, 2006, 38 (5):541 -547.
[4]Xie YZ, Li SZ, Albert Y, et al Ganoderma lucidum inhibits tumour cell proliferation and induces tumour cell death[J] .Enzyme Microb Tech, 2006, 40(1):177 -185.
[5]刘菊研,刘少勇,金铃,等.口服灵芝孢子油对小鼠免疫功能的影响[J] .中华中医药杂志, 2006, 21(5):300 -301.
[6]高杨, 邓新国, 孙倩娜 , 等.灵芝孢子油对 N-甲基-N-亚硝酸脲诱导的大鼠视网膜损伤中 Caspase23表达的影响[J] .中国药理学通报, 2009, 25(7):871 -875.
[7]Van Delft MF,Huang DC.How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis[J] .Cell Res,2006, 16(2):203 -213.
[8]Jain RK,Di Tomaso E,Duda DG, etal.Angiogenesis in brain tumours[ J] .Nat Rev Neurosci, 2007, 8(8):610-622.
[9]Harper SJ,Bates DO.VEGF-A splicing:the key to anti-angiogenic therapeutics[J].Nat Rev Cancer,2008, 8(11):880 -887.
[10]Yu L,Chen SW.Toll-like receptors expressed in tumor cells:targets for therapy[J] .Cancer Immunol Immun,2008, 57(9):1271 -1278.
[11]Rakoff-Nahoum S,Medzhitov R.Toll-like receptors and cancer[J] .Nat Rev Cancer, 2009, 9(1):57 -63.
[12]Salaun B,Lebecque S,Matikainen S,et al.Toll-like receptor 3 expressed by melanoma cells as a target for therapy[J] .Clin Cancer Res, 2007, 13(15):4565 -4574.
