黑狼KB等位基因的演化史与多效性功能探究
对于狼来说，灰色是其最典型的毛色，也符合大多数人对于狼的印象，它们并非单一的灰色，其腿部、胸腹部有浅色毛发。但在北美，狼的黑化频率很高，很多地区的种群中的黑化个体甚至接近一半，尤其在西部地区。而在加拿大东部与五大湖地区黑狼则不太常见。在北美北极地区，狼的毛发基本为白色。（灰色毛发的狼随着年龄增长导致细胞色素减少或面临生理压力时其毛发也有可能变为奶油色或白色，而黑色毛发的狼会变为银色或白色）。

毛发颜色受年龄影响：黄石国家公园峡谷狼群的雌性头狼——白女士，随着年龄增长毛色从灰色变成白色（左下）；10岁的峡谷狼群雄性头狼712M，随着年龄增长毛色由深黑色变为浅银色（右下）

而在旧大陆，黑狼在可靠的文献记录中非常罕见，从19世纪开始可以找到零星报道，如今旧大陆的野生黑狼通常出现在狼与家犬有杂交的种群中。而对于国内一些圈养狼中出现的黑狼，个人推测基本上为进口的原产于北美的狼或北美狼与本土狼杂交造成的，而非纯种的本土狼。

黑色意大利狼

黑色印度狼

拉达克的黑色藏狼/喜马拉雅狼

国内新疆某养狼基地饲养的狼，黑狼为从国外进口（可能是从俄罗斯引进的加拿大狼）；部分灰狼目测有北美狼的影子，部分目测可能有狗子成分（包括最近引进的所谓“白狼”也目测为狼狗杂交），这些与本土狼外观有一定区别，大概率与不同地区的狼串过。单从血统这点来看就不得不吐槽 这打着保护狼的旗号却连纯种本土狼都不是不知道是保护了个啥（想起某位网友的吐槽：如果拿这些狼作为样本去参与某些关于狼和家犬分类的研究，那结果肯定乱套）…还有整天标榜自己“野生动物保护区”，却连野生动物保护区最基本应有的自然栖息地与生态系统都没有…把一堆动物圈起来养着就自称野生动物保护区了，挺搞笑的…

早在1880年黄石公园一位黄石公园第二任园长诺里斯（Philetus W. Norris）在做当年年度报告时，就描述过一种介于灰色的布法罗狼（buffalo wolf）与郊狼之间的黑褐色犬科动物，在公园中很常见。个人猜测，他对于该物种的描述可能就是指的黑化的狼，当时他很可能把灰色毛发与黑色毛发狼当成两个不同的物种。

在1939年至1941年间，第一个在野外研究狼的博物学家——国家公园管理局阿道夫·穆里（Adolph Murie）对麦金利山国家公园（后被更名为德纳利国家公园）对野生狼进行了生态学研究，并在他1944年的专著《麦金利山的狼》（The Wolves of Mount McKinley）中描述了狼毛色的多样性，并推测原因可能和野外狼与家犬的杂交有关。

《麦金利山的狼》第28页 截图

在之后的一些研究中也发现了黑狼表型在种群中的高频率现象，如在20世纪40年代至21世纪初对贾斯帕国家公园及其周边的狼的观察中发现黑狼在种群中的频率通常要高于50%，部分时段甚至可达到80%。同样在黄石国家公园，黑狼在种群内的频率也非常高。

黄石国家公园的一个狼群，黑狼占比很高

在2007年，有学者使用基因组连锁扫描（genomewide linkage scan）的方法，对拉布拉多犬和灵缇犬杂交产生的黑色、虎斑色与黄色毛发的后代进行分析，并对多个标记进行孟德尔遗传规律的验证，发现这些犬只的毛色转换由K基因座控制，并得出了三种等位基因的显隐性关系，即黑 (KB) >虎斑 (kbr) > 黄 (ky)。研究结果也将K基因座定位于家犬的16号染色体上，并且将KB突变映射到16号染色体远端遗传标记REN292N24和FH3592之间12 Mb间隔的区域。最后也提出了两种K基因座作用模型 ：第一种是K基因是Agouti基因的上位基因并抑制后者的功能。或者其产物作为Agouti mRNA表达的负性调节因子，抑制其表达。或作为翻译后抑制剂，降低 Mc1r（受体）处有活性的Agouti蛋白（胚体）的水平；第二种是K基因产物直接作用于MC1R，从而刺激真黑素信号通路的活性，间接抵消Agouti蛋白的作用。最终的结果都是促进真黑素合成，使家犬呈现黑色毛发。
同年，Candille等人的研究团队基于生化和细胞实验揭示了KB基因使家犬毛色变黑的分子机制。由于先前的研究已经将KB突变定位到16号染色体的一个区间内，学者使用基于连锁的方法来缩小关键区间，并通过对成熟编码区测序，发现了与KB基因相关的几个多态性。在排除了其他基因已知的上位效应对表型的影响后，他们发现第23位甘氨酸缺失与KB突变完全连锁不平衡（一起遗传），从而它们确定了KB突变的位置，这种CBD103的这种框内缺失（CBD103ΔG23）正是KB突变。研究者还利用人工合成的CBD103和CBD103ΔG23蛋白去分别测试与Agouti与MC1R的互作，CBD103ΔG23能够更有效地与Agouti蛋白竞争对Mc1r受体，从而有利于真黑素产生，从而调节家犬毛色。

到了2009年，Anderson等人的团队发现KB突变也会导致狼的毛色呈现黑色，并发表了对KB等位基因的演化史的研究，他们通过对32只北极狼和15只无血缘关系的黄石狼以及12只家犬中的相关片段进行了测序并进行单倍型分析，发现狼K基因座相关片段的连锁不平衡模式与家犬相似，及它们的这个区域的遗传结构与演化史可能较为相似。扩展单倍型纯合性（EHH）分析也表明KB经历过近期的选择性清除（由于KB是有利突变，该突变受到正向选择而趋于固定，而与之一起遗传的中性位点也会随着有利突变的固定而随之固定下来，取代原有位点的多态性，因此在一段时间内KB单倍型会呈现出高频率，低遗传多样性的模式）。研究者还基于CBD103核心区构建了一个简易的邻接树，通过系统发育分析表明KB突变发生在单一物种中，随后通过杂交出现在家犬、狼与郊狼身上。他们通过分子钟的方法估计得该变体至少有约47000年的历史（有95%的概率该突变发生在约13000～121000年间的某个时间点），并推测携带该变体的家犬随着美洲原住民在约12000～14000年前到达北美，并在约500～14000年前通过与狼杂交将KB基因引入北美狼种群。学者还推测黑狼在森林地区有选择优势，并认为狼的毛色与其栖息地有很强的相关性。这种突变从家畜引入野生种群，并丰富了野生种群的基因库，使野生种群能更好地适应环境。

从事该研究的学者也提到相同的KB变体至少三次进入野生犬科动物种群，即北美狼、意大利狼与郊狼，但黑色毛发喜马拉雅狼的情况尚不明晰。但也有学者依据狼的捕猎习性认为，由于狼是追逐型猎手，经常活跃在开阔显眼的地方追踪猎物，并不依靠在夜间伏击狩猎，因此所谓黑狼在森林中的隐蔽色可能不是对其生存有利的重要因素。20世纪人类对狼的狩猎活动中黑狼可能会更容易被发现从而受到选择压力。一些学者也提出苔原地区的黑狼在夏季可能会容易过热，而白狼则更容易耐高温（个人感觉脑洞大开了真是）。
一些学者认为应该纳入对美东地区犬科的研究来获得更可靠的结论，他认为KB还有可能源于北美东部地区的黑色犬科动物（Canis niger，C. rufus以及C. lycaon），并在威斯康星冰期（11000～18000年前）渐渗进入狼（C. lupus）体内。而研究团队回应道这样的研究最多只能丰富他们得出的结论，因为已经有几个独立的证据表明家犬的KB比样本狼的更古老，家犬的KB也有相对较高的多态性且在全球分布更广，因此KB起源于美东地区类狼犬科动物并扩散到北美狼以及世界各地家犬中的假设是站不住脚的。

由于KB基因是一种有益突变，且KB单倍型在近期经历了选择性清除，因此研究人员对其适应性也产生了兴趣。为了更好地理解该基因的功能和作用，研究人员进一步对KB基因进行了探究。先前提到有学者认为黑色毛发可能作为在森林地区的一种隐蔽色，这个观点在提出时就有人产生质疑。一些学者则将注意力放在KB基因的多效性作用上，即KB基因所带来的黑色毛发可能不会直接带来适应性优势，而是通过影响其他的表型来提供生存优势。

2011年，Coulson等人的研究团队将群体遗传学与数学建模方法相结合，280只狼进行了采样，使用积分投影模型（IPMs，广泛应用于生态学、演化生物学和自然资源管理等领域，应用于预测种群动态、生活史策略、密度制约、环境过滤等方面）对黄石国家公园对狼展开生态学研究。结果发现杂合黑狼（KB/ky）要比纯合黑狼（KB/KB） 纯合灰狼（ky/ky）有更高的年存活率与年繁殖率，也有更长的世代长度（母亲到其后代的平均时间间隔），其终身繁殖成功率也是最高的。而纯合黑狼（KB/KB）在各方面都是最差的，可能这也是该基因型频率本身也非常低的原因，在种群中很罕见。其结果也说明黑色毛发可能并不会带来直接的选择优势，也与之前对隐蔽色的质疑相呼应。作者推测KB突变的选择优势可能与该其他功能有关（即多效性），如KB突变可以在细胞免疫中发挥作用。黄石国家公园的黑狼也存在着平衡选择的现象（杂合子适合度最高，从而维持该基因座的多态性）。
2013年，Stahler等人利用长达14年的黄石国家公园狼长期研究数据，使用多变量混合效应模型评估了狼本身不同性状和生态因素对繁殖雌性灰狼的繁殖情况（产仔数和存活率）的相对影响。结果发现灰色雌狼比黑色雌狼的繁殖成功率更高。雌性杂合黑狼的产下的幼崽年存活率比雌性纯合灰狼要低25%。而KB又可能提高黑狼的免疫力。学者并将其解释为免疫与繁殖投入的能量平衡/权衡（trade off），他们推测KB基因可能为杂合黑狼提供了更强的免疫力，而它们在免疫相关的能量投入的上升可能会增加抚养幼崽的成本。
在2014年，Hedrick等人使用Coulson团队的数据，并根据假设适合度值，计算KB基因的预计频率随时间的变化，并与实际频率进行比较。结果证明了杂合黑狼又很强的杂合优势，其适合度高于纯合灰狼。作者也提到了黄石狼种群中存在负选型交配（即倾向选择与自己表型不同的异性结为配偶，黑狼通常会与灰狼形成配偶）。同时作者也反驳了黑色毛发带来的隐蔽性优势，也正如他在2009年对Anderson等人的研究提出的质疑。

2015年，对伊朗西部的黑狼进行了线粒体DNA、微卫星以及形态学分析，发现样本中2只黑狼在过去的一代或两代代中没有杂交迹象。作者推测伊朗西部有黑色毛发的狼并不一定是近代与家犬杂交造成的基因污染的结果，可能是在野生狼中自然形成的，也有可能是与古代流浪狗杂交导致的。这与意大利的那些由于近期杂交而形成的黑狼不同（而在2004年一篇对一只意大利黑狼的微卫星分析也得出了与这次伊朗狼相似的结论）。

在1995年至2015年在黄石国家公园记录的狼的261次交配中，63.6%是灰狼和黑狼之间的交配。2016年Hedrick等人探究了黄石狼的负选型交配模式，他们首先分析了这21年间的交配数据，并提出了一个负选型交配模型，同时探讨负选型交配的潜在影响，并将估计值与观察值进行比较与分析。结果显示在杂合优势的前提下，黄石狼的负选型交配可以更有力地解释当地狼毛色多态性维持的原因。并且通过与其他物种的数据进行比较，发现狼的负选型交配是哺乳动物中唯一被文献记录的案例，也是脊椎动物中唯一被记录的自然发生的基因多态性案例。而这对于其他一些物种来说通常与基因倒位、人工选择或环境因素有关，并不普遍。正是因为黄石国家公园的独特性，使得在当地可以对接近自然状态的狼种群进行充分的生态观察与种群监测，才能得出这一结论。正如世界顶级狼专家大卫·梅奇（L. David Mech）所说：“黄石公园是世界上观察和研究狼的最佳地点”。

2017年，Cassidy等人通过对黄石国家公园中狼的个体行为观察，对狼群之前的互动进行了评估，并将毛色纳入分析。结果发现黑狼在与其他狼的攻击性互动中表现出的攻击性要低于灰狼，并且对皮质醇的检测结果表明灰狼的皮质醇水平高于黑狼。结合先前对于家犬毛色与基础皮质醇水平的研究，学者推测K基因座的多效性会影响狼的皮质醇激素分泌，降低黑狼糖皮质激素，使得黑狼的基础皮质醇水平低于灰狼，进而影响到狼的行为。

由于2009年Anderson等人团队的研究采样比较有限，KB等位基因的演化史细节，如有从家犬到狼的引入事件到底有几次、发生的时间和地理来源仍然未知。到了2018年，Schweizer等人设计了一个杂交捕获阵列，对北美洲多个种群的狼和20个家犬品种进行了这些区域的测序，评估了核苷酸和单倍型多样性模式、连锁不平衡衰减以及种群间遗传分化的层次模式，并评估了KB等位基因在每个种群样本中的可能起源时间。结果发现K基因座受到选择压力，出现了强烈的选择性清除迹象（有优势的KB在种群中趋于固定，周围与其连锁的一些SNP（单核苷酸多态性位点，包括中性位点）会通过搭车效应随之固定下来，取代原有的SNP位点，使含KB的单倍型遗传多样性下降，但频率升高。由于KB没有完全取代ky，表示KB纯合可能有某种致死机制，该基因型的个体也非常罕见。对于K基因座的扩展单倍型纯合性（EHH）分析显示，相对于家犬，狼的KB单倍型有更广泛的纯合性，也符合选择性清除的情况。基于种群统计数据的结果显示，育空地区狼种群的KB单倍型多样性最高，其次是西北地区，而样本量最大的黄石地区则是最低的（虽然这个从3个不同地区引入的种群在其他方面有较高的遗传多样性），显示出育空和西北地区可能最接近引入事件发生的地点。而通过模型对等位基因频率的推演却排除了之前假设的KB基因的致死效应，显示KB纯合个体数量少可能是自然选择的结果。基于KB单倍型构建的邻接树也显示了北美狼中的KB等位基因的渗入只发生过一次（说明当时人口少，家犬和狼互动机会少，只有一次引入事件传播并流传下来。或者引入世界发生过多次，只有一次得以流传至今），而意大利狼中的KB基因相对于北美狼来说是独立起源的。对于引入事件发生的时间都估计结果显示，样本种群中最古老的引入事件发生的约1598～7248年前的育空地区。因此唯一成功流传下来KB等位基因引入事件可能发生在加拿大北极地区，此后迅速蔓延到整个大陆，使其他狼种群的KB单倍型多样性降低。该事件是最近发生的，这是脊椎动物中已知的传播速度最快的适应性变体的之一，这可能与狼强大扩散能力有关。