1、转膜不充分
(1)膜没有完全均匀湿透
使用100% methanol浸透膜。
(2)靶蛋白分子量小于10 000
选择小孔径的膜，缩短转移时间。
(3)靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值
可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液。
(4)甲醇浓度过高
过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替。
(5)转移时间不够
对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间。
2、背景高
(1)膜没有完全均匀湿透
使用100% methanol浸透膜。
(2)洗膜不充分
增加洗液体积和洗涤次数。
(3)阻断不充分
增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等）。
(3)二抗浓度过高
降低二抗浓度。
(4)检测过程中膜干燥
保证充分的反应液，避免出现干膜现象。
(5)曝光过度
缩短曝光时间。
(6)抗体与阻断蛋白有交叉反应
检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应。
3、没有阳性条带
（1）抗体染色不充分
增加抗体浓度，延长孵育时间。
（2）酶失活
直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。
（3）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低
设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。
（4）试剂不匹配
一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性。
（5）一抗失效
选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液。
（6）HRP抑制剂
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。
4、有阳性条带，但条带比较弱
（1）抗体染色不充分
增加抗体浓度，延长孵育时间。
（2）酶活性降低
直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。
（3）标本中靶蛋白含量太低
增加标本上样量。
（4）洗膜过度
缩短洗涤时间。
（5）HRP抑制剂
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。
（6）抗体活性降低
选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置。
（7）封闭过度
减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型。
（8）曝光时间过短
延长曝光时间。
（9）HRP抑制剂
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。
5、条带位置（大小）不对；或有非特异性条带
（1）二抗的非特异性结合
增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）。
（2）一抗的特异性不够
使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性。
（3）蛋白降解
使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂。
（4）二聚体或多聚体存在
增加蛋白质变性过程及强度。
（5）抗体浓度过高
降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带。
（6）蛋白上样量过大
降低上样量。
6、背景有斑点
（1）封闭剂中有聚集体
使用前过滤封闭试剂。
（2）HRP耦联二抗中有聚集体
过滤二抗试剂，去除聚集体。
7、膜上出现反像（暗背景上白色带）
（1）HRP含量过高
降低酶联二抗的浓度。