HPLC法测定水溶液中扑热息痛含量
一、教学目标：
1. 认识HPLC的结构，熟悉HPLC操作
2. 了解HPLC进行分离、定性、定量的方法。
二、教学内容：
1.      高效液相色谱（HPLC）仪器简介
色谱分离的基本原理：组分在固定相与流动相中的分配系数不同。根据流动相不同，可以分为气相、液相色谱。液相色谱最为常见。
有机合成实验中常使用常规尺寸的硅胶柱：分离量大、分离度低、分离速度慢、只能对部分物质做半定量。提高分离效率、稳定性和定性、定量能力的办法：减小颗粒尺寸和粒径分布，增加管长度、均匀地填充固定相。但这些措施往往增加柱传质阻力。因此发展出使用微米级颗粒为固定相材料、泵驱动液体流动进行分离的方法即高效液相色谱法。
历史上有高压液相和高效液相之说。分析型色谱和制备型色谱的概念。我们主要学习分析型色谱。
           
        
     
  
三、仪器组成：
以我实验室分离二茂铁(Fc)标记的DNA溶液为例（上图右）。
HPLC系统一般应包括：流动相、泵、进样阀、分离柱、检测器直至废液瓶等部分。
溶液：可以是一种溶剂。或几种溶剂的固定配比。叫做“等度洗脱”。对于一些实验，往往需要两种以上溶剂并且连续调节流动相的配比，这叫“梯度洗脱”。梯度洗脱需要用两个以上的试剂瓶和两个泵。我们现有的两台HPLC，分别有一个和两个泵。今天的HPLC法测定水中扑热息痛含量实验将是一个等度洗脱的实验。所以两台仪器都符合实验要求。
泵：由于传质阻力大，为达到快速分离，必须使用泵驱动液体。
泵的种类：蠕动泵、螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵等。往复泵成为主流。如下图所示。
           
        
     
  
螺旋注射泵                         往复泵工作原理
通道：～100um管道，稳定性好，能减小死体积、使用流体量小。
进样阀：通过采样环控制进样量。通常使用6通阀进行进样。其结构如下图：
           
        
  
六通阀为上下两层结构，溶液通过两层上各6个小孔连通。可以通过转动控制采样环进入或离开流路。在“load”位置时，可以将样品打入采样环（图中4-6的管道）。当把阀转至“inject”位置时，样品被带入到流路中，形成一段“样品塞”。除了HPLC，很多流动进样的仪器都使用类似的六通阀进样，所以了解六通阀结构是必要的。
  
   
  
因为样品是存放在采样环中，通过转动阀体进入流路。因此，和气相色谱不同，使用HPLC时不需要快速注射样品。进样针采样量也不要很准，在我们实验中，由于采样环为20mL，因此进样针吸取溶液超过20uL都可以。因为实际采样是依靠进样环控制的，多注入的样品被直接排入废液小瓶。注意不要打入气泡。把阀旋转至“inject”的时候也不用很快，推倒底就可以。如果不推到底，液体被堵在进样阀里，压力会升高，可能导致泵、阀损坏。