最可能的就是第三步的问题，细胞破碎做的不好或者出现了降解的问题

1.目的片段胶回收之后半个月是4℃还是-20℃存放，-20℃的话应该没降解，不过片段不建议放这么久，可以考虑重新p
2.菌p应该用目的片段的特异性引物，如果你们组一直用通用引物其他人也能P出来那就那样
3.如果以上两点没问题，大概率是没连上。不要以为连接之后做转化，抗性平板长了菌一定就是阳性，做的多了就会发现长的菌做菌P发现阴性或者假阳性是常事，因为会有很多种情况，比如双酶切处理的空载体会自连，酶切时间太长粘性末端被过度消化，涂板涂的不好，挑了卫星型菌落等

引物二聚体还是短片段啊，给张图。
有克隆就说明转进去质粒了。
感觉还是你pcr没做好，引物设计的不好，菌液少加一点，95度多煮一会，换引物再扩增

菌p不出东西可能是pcr的问题，也可能是没连进去。（通用引物的话无论有没有转进去应该一定能出条带）
是不是片段太长了，酶的持续合成能力不够，导致连入目标片段的载体反而扩不出条带来?
如果不差钱的话可以花几十块钱让生物公司拿通用引物跑三个测序反应