代谢异常是肿瘤细胞的重要特征之一，与肿瘤发生发展密切相关。氨基酸代谢是肿瘤代谢偏好的重要特征，是肿瘤诊疗的潜在靶点。本文介绍丝氨酸合成代谢在肝癌中的功能和机制，为丝氨酸代谢异常的靶点开发提供分子基础。
2024年6月，四川大学王魁研究团队在Nature Communications杂志上，发表“FBXO7 ubiquitinates PRMT1 to suppress serine synthesis and tumor growth in hepatocellular carcinoma”的研究成果，揭示了E3泛素连接酶FBXO7通过促进 PRMT1泛素化降解、抑制丝氨酸代谢和肝癌生长的分子机制，可为靶向丝氨酸代谢的肿瘤治疗策略提供新思路。
FBXO7: F-box only protein 7，E3 ubiquitin ligase.
PRMT1: Protein arginine N-methyltransferase 1.
PHGDH: D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, the first step of L-serine biosynthesis pathway.
图形摘要：
Highlights如下：
1）FBXO7 在人 HCC 组织中下调，与 PRMT1 蛋白和 PHGDH 甲基化水平呈负相关。
2）FBXO7具有肿瘤抑制作用。
3）机制上，FBXO7可介导PRMT1第37位赖氨酸泛素化修饰和蛋白酶体降解，从而降低PHGDH的精氨酸甲基化水平，抑制丝氨酸合成，诱导氧化应激，抑制肝癌细胞生长。
临床相关性：FBXO7 在人 HCC 组织中显著下调。
功能研究：FBXO7通过抑制肝癌中丝氨酸合成发挥抑癌功能。
机制研究：蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）介导的蛋白精氨酸甲基化已成为癌症发病过程中常见且重要的翻译后蛋白修饰。据报道，PRMT1蛋白水平在HCC中上调以促进肿瘤发展，其高水平与HCC患者的不良临床预后相关。FBXO7是E3泛素连接酶，FBXO7在肺癌、结肠癌和子宫内膜癌等多种癌症中表达异常。然而，FBXO7是否在HCC中发挥作用尚不清楚。
（1）FBXO7与PRMT1相互作用
第一步，探讨PRMT1在肝细胞癌中上调的机制
已有结果显示，PRMT1的蛋白水平在HCC中上调，但PRMT1 mRNA水平没有变化。推测泛素-蛋白酶体降解可能参与PRMT1的上调。用两种不同的蛋白酶体抑制剂处理细胞，发现PRMT1蛋白水平呈剂量依赖性增加（图1a），表明PRMT1的蛋白水平可以通过泛素介导的降解来调节。
第二步，确定PRMT1降解的关键泛素连接酶
根据设计的筛选策略，E3泛素连接酶FBXO7为候选互作蛋白（图1b-c）。IP-MS分析显示FBXO7是前10个与PRMT1相互作用的候选E3连接酶中唯一的E3泛素连接酶（图1d）。
第三步，确定FBXO7作为E3连接酶参与PRMT1的降解及其互作关系
外源、内源Co-IP实验显示FBXO7与PRMT1相互作用（图1e-h）。Co-IP实验发现，敲减PRMT1后，FBXO7与PRMT1相互作用减弱（图1i-j）。另外，GST pulldown实验证实FBXO7与PRMT1直接相互作用（图1k）。
第四步，确定FBXO7与PRMT1结合的具体位置
针对FBXO7和PRMT1，分别构建不同截短突变体并进行Co-IP分析，发现PRMT1与FBXO7的结合需要PRMT1的催化结构域(23-162aa)（图1l-n），而FBXO7与PRMT1的结合需要FBXO7的泛素样结构域(UBL，1-78aa)和FBXO7-PI31二聚化结构域(FP，181-324aa)（图2o-q）。表明FBXO7与PRMT1直接相互作用。
图1 FBXO7与PRMT1相互作用（Ref. Fig 1/S1）
（2）FBXO7通过泛素介导的降解下调PRMT1蛋白水平
第一步，确定FBXO7下调PRMT1蛋白水平的机制
基于FBXO7和PRMT1的相互作用，推测FBXO7通过泛素-蛋白酶体降解系统，降低PRMT1蛋白水平。敲减FBXO7显著提高PRMT1的蛋白水平，但不影响其mRNA水平（图2a-c）。另外，蛋白酶体抑制剂处理后，FBXO7敲减没有上调PRMT1蛋白水平，相反，消除了FBXO7过表达对PRMT1蛋白水平的抑制作用（图2d-e）。此外，放线菌酮实验显示，FBXO7敲减明显延长PRMT1蛋白的半衰期（图2f）。表明FBXO7可能通过泛素-蛋白酶体降解来下调PRMT1蛋白水平。
第二步，确定FBXO7是否泛素化PRMT1
构建FBXO7野生型(WT)或ΔF-box突变体(酶促死亡突变体)并进行Co-IP实验分析，发现FBXO7-WT的表达显著增加PRMT1的泛素化水平（图2g-h），而ΔF-box突变体则没有(图2f)。另外，FBXO7敲减显著降低PRMT1的泛素化水平（图2i）。同样，FBXO7 敲减导致内源性PRMT1泛素化水平显著降低（图2j）。这些结果表明，FBXO7通过泛素修饰降解系统下调PRMT1蛋白。
图2 FBXO7促进泛素介导的PRMT1降解（Ref. Fig 2/S3）
第三步，确定PRMT1的泛素化位点
对泛素化的PRMT1进行IP-MS分析，发现PRMT1潜在的4个赖氨酸残基(K37、K82、K202、K325)泛素化位点（图3a-b）。构建泛素化位点突变体（K37R, K82R, K202R, K325R）进行Co-IP分析，在K37R突变体中PRMT1的泛素化水没有变化，其它突变体和野生型PRMT1的泛素化水平明显升高（图3c）。此外，Co-IP实验显示，过表达FBXO7导致野生型PRMT1水平明显降低，但对突变型K37R无明显影响（图3d）。另外，敲低FBXO7显著增加野生型PRMT1的半衰期，但对K37R突变体的半衰期无影响（图3e）。表明K37是FBXO7介导的PRMT1的主要泛素化位点。
（3）FBXO7通过下调PRMT1表达抑制PHGDH甲基化和活性
之前的研究表明， PHGDH在肝癌中被过度激活，从而促进丝氨酸合成和维持氧化还原稳态。PRMT1的上调使PHGDH的过度活化，从而诱导PHGDH在第236位精氨酸的甲基化和随后的活化。鉴于FBXO7通过泛素介导的降解下调PRMT1，那么FBXO7是否降低PHGDH的甲基化和活性？
第一步，FBXO7通过下调PRMT1抑制PHGDH甲基化
IP-WB实验发现，发现FBXO7敲减显著提高PHGDH的甲基化水平，同时增加PRMT1的表达（图3f）；相反，FBXO7高表达降低PHGDH甲基化水平和PRMT1的表达（图3g）。此外，IP-WB还发现，PRMT1敲减恢复了FBXO7敲减细胞中PHGDH-R236甲基化水平（图3h）；过表达PRMT1-K37R突变体明显恢复FBXO7过表达细胞中下降的PHGDH甲基化水平（图3i）。表明FBXO7通过下调PRMT1抑制PHGDH甲基化。
第二步，FBXO7通过下调PRMT1抑制PHGDH催化活性
FBXO7敲减增加PHGDH催化活性（图3j），而FBXO7敲减诱导的PHGDH活性升高被PRMT1 敲减显著挽救（图3k）。PRMT1的K37R突变体恢复了FBXO7过表达导致的PHGDH活性下降，而PRMT1的野生型没有恢复（图3l）。
表明FBXO7通过下调PRMT1的表达来抑制PHGDH R236甲基化和催化活性。
图3 FBXO7介导PRMT1 K37位点泛素化，通过下调PRMT1抑制PHGDH甲基化和活性（Ref. Fig3/4）
结论：本文揭示FBXO7通过抑制肝癌丝氨酸合成发挥抑癌的功能和分子机制。具体而言，FBXO7作为E3泛素连接酶，直接与PRMT1相互作用，导致PRMT1泛素化和随后的泛素-蛋白酶体降解。FBXO7介导的PRMT1降解可阻止PHGDH甲基化活化，从而抑制丝氨酸合成，加重氧化应激，抑制HCC生长。本研究揭示了FBXO7-PRMT1-PHGDH轴在肝癌丝氨酸代谢调节中的分子机制，为丝氨酸代谢的靶向诊疗提供分子基础。
2024年6月，四川大学王魁研究团队在Nature Communications杂志上，发表“FBXO7 ubiquitinates PRMT1 to suppress serine synthesis and tumor growth in hepatocellular carcinoma”的研究成果，揭示了E3泛素连接酶FBXO7通过促进 PRMT1泛素化降解、抑制丝氨酸代谢和肝癌生长的分子机制，可为靶向丝氨酸代谢的肿瘤治疗策略提供新思路。
FBXO7: F-box only protein 7，E3 ubiquitin ligase.
PRMT1: Protein arginine N-methyltransferase 1.
PHGDH: D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, the first step of L-serine biosynthesis pathway.
图形摘要：
Highlights如下：
1）FBXO7 在人 HCC 组织中下调，与 PRMT1 蛋白和 PHGDH 甲基化水平呈负相关。
2）FBXO7具有肿瘤抑制作用。
3）机制上，FBXO7可介导PRMT1第37位赖氨酸泛素化修饰和蛋白酶体降解，从而降低PHGDH的精氨酸甲基化水平，抑制丝氨酸合成，诱导氧化应激，抑制肝癌细胞生长。
临床相关性：FBXO7 在人 HCC 组织中显著下调。
功能研究：FBXO7通过抑制肝癌中丝氨酸合成发挥抑癌功能。
机制研究：蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）介导的蛋白精氨酸甲基化已成为癌症发病过程中常见且重要的翻译后蛋白修饰。据报道，PRMT1蛋白水平在HCC中上调以促进肿瘤发展，其高水平与HCC患者的不良临床预后相关。FBXO7是E3泛素连接酶，FBXO7在肺癌、结肠癌和子宫内膜癌等多种癌症中表达异常。然而，FBXO7是否在HCC中发挥作用尚不清楚。
（1）FBXO7与PRMT1相互作用
第一步，探讨PRMT1在肝细胞癌中上调的机制
已有结果显示，PRMT1的蛋白水平在HCC中上调，但PRMT1 mRNA水平没有变化。推测泛素-蛋白酶体降解可能参与PRMT1的上调。用两种不同的蛋白酶体抑制剂处理细胞，发现PRMT1蛋白水平呈剂量依赖性增加（图1a），表明PRMT1的蛋白水平可以通过泛素介导的降解来调节。
第二步，确定PRMT1降解的关键泛素连接酶
根据设计的筛选策略，E3泛素连接酶FBXO7为候选互作蛋白（图1b-c）。IP-MS分析显示FBXO7是前10个与PRMT1相互作用的候选E3连接酶中唯一的E3泛素连接酶（图1d）。
第三步，确定FBXO7作为E3连接酶参与PRMT1的降解及其互作关系
外源、内源Co-IP实验显示FBXO7与PRMT1相互作用（图1e-h）。Co-IP实验发现，敲减PRMT1后，FBXO7与PRMT1相互作用减弱（图1i-j）。另外，GST pulldown实验证实FBXO7与PRMT1直接相互作用（图1k）。
第四步，确定FBXO7与PRMT1结合的具体位置
针对FBXO7和PRMT1，分别构建不同截短突变体并进行Co-IP分析，发现PRMT1与FBXO7的结合需要PRMT1的催化结构域(23-162aa)（图1l-n），而FBXO7与PRMT1的结合需要FBXO7的泛素样结构域(UBL，1-78aa)和FBXO7-PI31二聚化结构域(FP，181-324aa)（图2o-q）。表明FBXO7与PRMT1直接相互作用。
图1 FBXO7与PRMT1相互作用（Ref. Fig 1/S1）
（2）FBXO7通过泛素介导的降解下调PRMT1蛋白水平
第一步，确定FBXO7下调PRMT1蛋白水平的机制
基于FBXO7和PRMT1的相互作用，推测FBXO7通过泛素-蛋白酶体降解系统，降低PRMT1蛋白水平。敲减FBXO7显著提高PRMT1的蛋白水平，但不影响其mRNA水平（图2a-c）。另外，蛋白酶体抑制剂处理后，FBXO7敲减没有上调PRMT1蛋白水平，相反，消除了FBXO7过表达对PRMT1蛋白水平的抑制作用（图2d-e）。此外，放线菌酮实验显示，FBXO7敲减明显延长PRMT1蛋白的半衰期（图2f）。表明FBXO7可能通过泛素-蛋白酶体降解来下调PRMT1蛋白水平。
第二步，确定FBXO7是否泛素化PRMT1
构建FBXO7野生型(WT)或ΔF-box突变体(酶促死亡突变体)并进行Co-IP实验分析，发现FBXO7-WT的表达显著增加PRMT1的泛素化水平（图2g-h），而ΔF-box突变体则没有(图2f)。另外，FBXO7敲减显著降低PRMT1的泛素化水平（图2i）。同样，FBXO7 敲减导致内源性PRMT1泛素化水平显著降低（图2j）。这些结果表明，FBXO7通过泛素修饰降解系统下调PRMT1蛋白。
图2 FBXO7促进泛素介导的PRMT1降解（Ref. Fig 2/S3）
第三步，确定PRMT1的泛素化位点
对泛素化的PRMT1进行IP-MS分析，发现PRMT1潜在的4个赖氨酸残基(K37、K82、K202、K325)泛素化位点（图3a-b）。构建泛素化位点突变体（K37R, K82R, K202R, K325R）进行Co-IP分析，在K37R突变体中PRMT1的泛素化水没有变化，其它突变体和野生型PRMT1的泛素化水平明显升高（图3c）。此外，Co-IP实验显示，过表达FBXO7导致野生型PRMT1水平明显降低，但对突变型K37R无明显影响（图3d）。另外，敲低FBXO7显著增加野生型PRMT1的半衰期，但对K37R突变体的半衰期无影响（图3e）。表明K37是FBXO7介导的PRMT1的主要泛素化位点。
（3）FBXO7通过下调PRMT1表达抑制PHGDH甲基化和活性
之前的研究表明， PHGDH在肝癌中被过度激活，从而促进丝氨酸合成和维持氧化还原稳态。PRMT1的上调使PHGDH的过度活化，从而诱导PHGDH在第236位精氨酸的甲基化和随后的活化。鉴于FBXO7通过泛素介导的降解下调PRMT1，那么FBXO7是否降低PHGDH的甲基化和活性？
第一步，FBXO7通过下调PRMT1抑制PHGDH甲基化
IP-WB实验发现，发现FBXO7敲减显著提高PHGDH的甲基化水平，同时增加PRMT1的表达（图3f）；相反，FBXO7高表达降低PHGDH甲基化水平和PRMT1的表达（图3g）。此外，IP-WB还发现，PRMT1敲减恢复了FBXO7敲减细胞中PHGDH-R236甲基化水平（图3h）；过表达PRMT1-K37R突变体明显恢复FBXO7过表达细胞中下降的PHGDH甲基化水平（图3i）。表明FBXO7通过下调PRMT1抑制PHGDH甲基化。
第二步，FBXO7通过下调PRMT1抑制PHGDH催化活性
FBXO7敲减增加PHGDH催化活性（图3j），而FBXO7敲减诱导的PHGDH活性升高被PRMT1 敲减显著挽救（图3k）。PRMT1的K37R突变体恢复了FBXO7过表达导致的PHGDH活性下降，而PRMT1的野生型没有恢复（图3l）。
表明FBXO7通过下调PRMT1的表达来抑制PHGDH R236甲基化和催化活性。
图3 FBXO7介导PRMT1 K37位点泛素化，通过下调PRMT1抑制PHGDH甲基化和活性（Ref. Fig3/4）
结论：本文揭示FBXO7通过抑制肝癌丝氨酸合成发挥抑癌的功能和分子机制。具体而言，FBXO7作为E3泛素连接酶，直接与PRMT1相互作用，导致PRMT1泛素化和随后的泛素-蛋白酶体降解。FBXO7介导的PRMT1降解可阻止PHGDH甲基化活化，从而抑制丝氨酸合成，加重氧化应激，抑制HCC生长。本研究揭示了FBXO7-PRMT1-PHGDH轴在肝癌丝氨酸代谢调节中的分子机制，为丝氨酸代谢的靶向诊疗提供分子基础。
