三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中最恶性的亚型。TP53突变是肿瘤常见的抑癌转促癌突变。在TNBC患者中，TP53突变率高达80%，其突变会导致化疗耐药或免疫治疗效果差等临床问题。因此，迫切需要阐明分子机制并确定TNBC进展的新靶点。
2024年7月，山东大学杨其峰团队在Adv Sci（IF=14.3）上，发表“CircCFL1 Promotes TNBC Stemness and Immunoescape via Deacetylation-Mediated c-Myc Deubiquitylation to Facilitate Mutant TP53 Transcription”的研究成果，提示了TNBC中突变TP53调控的新机制，并为TNBC患者提供了一种新的预后生物标志物和治疗靶点。
图形摘要：
Highlights如下：
1）circCFL1促进TNBC细胞的增殖、转移和干性。
2）circCFL1通过促进PD-L1的表达，抑制CD8 T细胞的抗肿瘤免疫，促进TNBC细胞的免疫逃逸。
3）机制上，circCFL1作为支架分子，增强HDAC1与c-Myc之间的互作，进而促进HDAC1介导的Myc去乙酰化，进一步阻止其K48泛素化降解，最终促进Myc蛋白稳定性积累。Myc蛋白直接结合TP53启动子促进突变TP53的表达，增强TNBC细胞干性增殖转移和免疫逃逸。
临床相关性：circCFL1在TNBC中表达上调并与患者预后不良相关。
功能研究：circCFL1促进TNBC细胞的增殖、转移和干性。
机制研究：
（1）circCFL1直接与HDAC1互作
第一步，初步筛选出与circCFL1的互作蛋白分子HDAC1为了阐明circCFL1对TNBC影响的潜在分子机制，进行RNA pull down实验，对显著富集的55 kD蛋白进行质谱分析（图1a），发现HDAC1是circCFL1的高潜蛋白（图1b）。分子对接显示circCFL1与HDAC1蛋白存在物理结合（图1c）。
第二步，确定circCFL1与HDAC1存在互作
FISH和IF检测发现circCFL1和HDAC1在细胞核中共定位（图1d）。RNA pull down-WB实验证实circCFL1和HDAC1相互作用（图1e）。
第三步，确定circCFL1与HDAC1结合的特定区域
首先，基于RNAfold预测的circCFL1茎环结构构建两个截断的同工型circCFL1，RNA pull down-WB实验发现两个亚型都可以与HDAC1相互作用（图1f-g）。进一步的HDAC1抗体RIP-qPCR实验，再次证实HDAC1与circCFL1相互作用（图1h）。随后的HDAC1截断体RIP-qPCR实验显示：circCFL1主要与HDAC1的去乙酰化结构域相互作用（图1i-j）。
第四步，探索circCFL1是否可以调节HDAC1的表达
circCFL1敲低和过表达不影响HDAC1的RNA或蛋白质水平，表明circCFL1不影响HDAC1的蛋白水平（图1k-l）。但HDAC1敲减表达能够有效抑制circCFL1的促癌功能（增殖、迁移、侵袭和干性）（图1m-o）。这些结果表明：circCFL1主要是通过影响HDAC1的生物学功能发挥促癌功能。
图1 circCFL1通过结合影响HDAC1的功能发挥促癌作用（Ref. Fig 4/S4）
（2）circCFL1/HDAC1结合靶蛋白c-Myc
第一步，circCFL1/HDAC1可能调控靶蛋白c-Myc
circCFL1如何影响HDAC1的分子功能，需要进一步探究。鉴定circCFL1和HDAC1的结合蛋白谱，有助于揭示潜在的调控机制。HDAC1抗体的IP-MS与circCFL1的pulldown-MS的互作谱分析结果显示：c-Myc蛋白可能是circCFL1/HDAC1调控的关键靶蛋白（图2a-b）。
第二步，确定circCFL1/c-Myc/HDAC1复合体
IF结果显示circCFL1和c-Myc具有相似的亚细胞定位（图2c）。进一步的RNA pull-down和RIP实验证实circCFL1与c-Myc互作（图2d-e）。Co-IP实验显示，HDAC1与c-Myc互作（图2f）。这些结果表明circCFL1、HDAC1和c-Myc蛋白形成复合体。
第三步，circCFL1增强HDAC1与c-Myc的互作
IF检测显示，在正常情况下，HDAC1和c-Myc都主要定位于细胞核，而当circCFL1被敲低时，部分c-Myc会转移到细胞质中（图2g）。Co-IP分析显示circCFL1促进HDAC1与c-Myc的互作（图2h）。这些结果表明circCFL1具有增强c-Myc细胞核功能的作用。
第四步，确定HDAC1的去乙酰化结构域与c-Myc互作
HDAC1和c-Myc截断Co-IP检测显示：c-Myc的中心区域与HDAC1互作（图2i-j）；而HDAC1的去乙酰化酶结构域和c-Myc蛋白结合（图2k）。这些结果暗示HDAC1可能参与c-Myc的乙酰化修饰调控。
第五步，HDAC1参与c-Myc的乙酰化修饰，促进c-Myc蛋白积累
HDAC I类抑制剂MS275处理，发现c-Myc的乙酰化水平可以显著改变（图2m）；敲低或过表达HDAC1可增强或抑制c-Myc蛋白的乙酰化（图2n），这些结果表明HDAC1参与c-Myc的乙酰化修饰。进一步的表达相关性研究发现HDAC1促进c-Myc的蛋白表达（图2l）。这些结果暗示HDAC1可能通过调控c-Myc蛋白的去乙酰化修饰，促进c-Myc蛋白的积累。
图2 circCFL1/HDAC1调控靶蛋白c-Myc（Ref. Fig 5/6）
（3）circCFL1/HDAC1通过K148位点去乙酰化c-Myc，通过抑制K48连接的多泛素化保护c-Myc免受降解
第一步，证明HDAC1的去乙酰化活性调控c-Myc的乙酰化水平构建HDAC1-H141A突变体，进行Co-IP分析，发现突变体对c-Myc的乙酰化水平没有影响（图3a），再次证实HDAC1的去乙酰化活性可以调节c-Myc的乙酰化水平。
第二步，circCFL1调控c-Myc的乙酰化修饰水平
circCFL1被沉默或过表达，检测c-Myc的乙酰化修饰水平，结果发现circCFL1参与c-Myc的乙酰化水平调节（图3b）。这些结果表明circCFL1可能通过HDAC1调节c-Myc蛋白的乙酰化修饰。
第三步，证实circCFL1/HDAC1诱导K148位点c-Myc去乙酰化
利用MusiteDeep (https://www.musite.net/)预测c-Myc蛋白有7个赖氨酸残基(K143、K148、K157、K275、K317、K323和K371) 可能发生乙酰化修饰（图3c）。分别构建K-to-R突变体，进行Co-IP分析，发现HDAC1过表达对c-Myc的K148R突变无显著影响，表明HDAC1对c-Myc的K148位点进行去乙酰化修饰（图3d）。进一步使用circCFL1和HDAC1敲减模型，通过Co-IP 乙酰化检测分析证实circCFL1/HDAC1参与调控c-MycK148位点的去乙酰化修饰（图3e-h）。
第四步，circCFL1/HDAC1诱导的c-Myc去乙酰化可能通过去泛素化来稳定c-Myc蛋白
检测发现，circCFL1/HDAC1轴促进c-Myc蛋白表达（图3i）。MS275处理细胞，显示c-Myc的高乙酰化水平不利于c-Myc蛋白水平的积累，表明c-Myc的乙酰化不利于蛋白的稳定（图3j）。环己亚胺(CHX)处理细胞表明，敲低HDAC1加速c-Myc蛋白的降解，表明HDAC1诱导的c-Myc去乙酰化可以稳定其表达（图3k）。此外，蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，表明HDAC1敲低诱导的c-Myc降解与泛素-蛋白酶体系统相关（图3l）。Co-IP分析显示MS275处理后，c-Myc的泛素化水平显著增加，证明抑制去乙酰化酶活性增强了c-Myc的泛素化水平（图3m）。同时，Co-IP实验发现，HDAC1和circCFL1的敲低或过表达也表明circCFL1/HDAC1轴抑制c-Myc的泛素化（图3n）。此外，Co-IP检测显示HDAC1的H141A突变对泛素化c-Myc的水平没有影响（图3o）。最后，Co-IP实验显示，HDAC1过表达后，c-Myc中K48相关的多泛素水平降低，而K63不降低（图3p）。
结果表明circCFL1/HDAC1轴可以通过c-Myc K148的去乙酰化，从而抑制c-Myc的K48多泛素化降解，从而促进c-
Myc蛋白积累。
图3 circCFL1/HDAC1轴在K148位点去乙酰化c-Myc，通过抑制K48链接的多泛素化保护c-Myc免受降解（Ref. Fig 6/7/S6）
（4）circCFL1/HDAC1/c-Myc轴促进突变体TP53的转录之前的研究结果表明circCFL1的功能与突变型TP53相关。JASPAR分析显示TP53启动子有4个潜在的c-myc结合基序（图3q）。ChIP实验证实所有四个基序都可以结合c-Myc，表明c-Myc与突变体TP53启动子互作（图3r）。双荧光素酶实验证实，circCFL1和HDAC1也可以加速TP53的转录，而TP53可以被c-Myc siRNA抑制（图3s）。证明circCFL1/HDAC1/c-Myc轴控制TP53突变细胞中TP53的转录。
结论：该研究中发现，circCFL1在TNBC细胞和组织中高表达，具有预后潜力。在功能上，circCFL1促进TNBC细胞的增殖、转移和干性。在机制上，circCFL1作为支架分子增强HDAC1与c-Myc互作，通过去乙酰化介导的K48泛素化修饰抑制，进一步增加c-Myc的稳定性。稳定表达的c-Myc直接结合TP53启动子进一步增强mutp53的表达，促进TNBC进展。该研究揭示了circCFL1通过促进HDAC1/c-Myc/mutp53轴发挥致瘤作用，可作为TP53突变TNBC患者的潜在诊断生物标志物和治疗靶点。
2024年7月，山东大学杨其峰团队在Adv Sci（IF=14.3）上，发表“CircCFL1 Promotes TNBC Stemness and Immunoescape via Deacetylation-Mediated c-Myc Deubiquitylation to Facilitate Mutant TP53 Transcription”的研究成果，提示了TNBC中突变TP53调控的新机制，并为TNBC患者提供了一种新的预后生物标志物和治疗靶点。
图形摘要：
Highlights如下：
1）circCFL1促进TNBC细胞的增殖、转移和干性。
2）circCFL1通过促进PD-L1的表达，抑制CD8 T细胞的抗肿瘤免疫，促进TNBC细胞的免疫逃逸。
3）机制上，circCFL1作为支架分子，增强HDAC1与c-Myc之间的互作，进而促进HDAC1介导的Myc去乙酰化，进一步阻止其K48泛素化降解，最终促进Myc蛋白稳定性积累。Myc蛋白直接结合TP53启动子促进突变TP53的表达，增强TNBC细胞干性增殖转移和免疫逃逸。
临床相关性：circCFL1在TNBC中表达上调并与患者预后不良相关。
功能研究：circCFL1促进TNBC细胞的增殖、转移和干性。
机制研究：
（1）circCFL1直接与HDAC1互作
第一步，初步筛选出与circCFL1的互作蛋白分子HDAC1为了阐明circCFL1对TNBC影响的潜在分子机制，进行RNA pull down实验，对显著富集的55 kD蛋白进行质谱分析（图1a），发现HDAC1是circCFL1的高潜蛋白（图1b）。分子对接显示circCFL1与HDAC1蛋白存在物理结合（图1c）。
第二步，确定circCFL1与HDAC1存在互作
FISH和IF检测发现circCFL1和HDAC1在细胞核中共定位（图1d）。RNA pull down-WB实验证实circCFL1和HDAC1相互作用（图1e）。
第三步，确定circCFL1与HDAC1结合的特定区域
首先，基于RNAfold预测的circCFL1茎环结构构建两个截断的同工型circCFL1，RNA pull down-WB实验发现两个亚型都可以与HDAC1相互作用（图1f-g）。进一步的HDAC1抗体RIP-qPCR实验，再次证实HDAC1与circCFL1相互作用（图1h）。随后的HDAC1截断体RIP-qPCR实验显示：circCFL1主要与HDAC1的去乙酰化结构域相互作用（图1i-j）。
第四步，探索circCFL1是否可以调节HDAC1的表达
circCFL1敲低和过表达不影响HDAC1的RNA或蛋白质水平，表明circCFL1不影响HDAC1的蛋白水平（图1k-l）。但HDAC1敲减表达能够有效抑制circCFL1的促癌功能（增殖、迁移、侵袭和干性）（图1m-o）。这些结果表明：circCFL1主要是通过影响HDAC1的生物学功能发挥促癌功能。
图1 circCFL1通过结合影响HDAC1的功能发挥促癌作用（Ref. Fig 4/S4）
（2）circCFL1/HDAC1结合靶蛋白c-Myc
第一步，circCFL1/HDAC1可能调控靶蛋白c-Myc
circCFL1如何影响HDAC1的分子功能，需要进一步探究。鉴定circCFL1和HDAC1的结合蛋白谱，有助于揭示潜在的调控机制。HDAC1抗体的IP-MS与circCFL1的pulldown-MS的互作谱分析结果显示：c-Myc蛋白可能是circCFL1/HDAC1调控的关键靶蛋白（图2a-b）。
第二步，确定circCFL1/c-Myc/HDAC1复合体
IF结果显示circCFL1和c-Myc具有相似的亚细胞定位（图2c）。进一步的RNA pull-down和RIP实验证实circCFL1与c-Myc互作（图2d-e）。Co-IP实验显示，HDAC1与c-Myc互作（图2f）。这些结果表明circCFL1、HDAC1和c-Myc蛋白形成复合体。
第三步，circCFL1增强HDAC1与c-Myc的互作
IF检测显示，在正常情况下，HDAC1和c-Myc都主要定位于细胞核，而当circCFL1被敲低时，部分c-Myc会转移到细胞质中（图2g）。Co-IP分析显示circCFL1促进HDAC1与c-Myc的互作（图2h）。这些结果表明circCFL1具有增强c-Myc细胞核功能的作用。
第四步，确定HDAC1的去乙酰化结构域与c-Myc互作
HDAC1和c-Myc截断Co-IP检测显示：c-Myc的中心区域与HDAC1互作（图2i-j）；而HDAC1的去乙酰化酶结构域和c-Myc蛋白结合（图2k）。这些结果暗示HDAC1可能参与c-Myc的乙酰化修饰调控。
第五步，HDAC1参与c-Myc的乙酰化修饰，促进c-Myc蛋白积累
HDAC I类抑制剂MS275处理，发现c-Myc的乙酰化水平可以显著改变（图2m）；敲低或过表达HDAC1可增强或抑制c-Myc蛋白的乙酰化（图2n），这些结果表明HDAC1参与c-Myc的乙酰化修饰。进一步的表达相关性研究发现HDAC1促进c-Myc的蛋白表达（图2l）。这些结果暗示HDAC1可能通过调控c-Myc蛋白的去乙酰化修饰，促进c-Myc蛋白的积累。
图2 circCFL1/HDAC1调控靶蛋白c-Myc（Ref. Fig 5/6）
（3）circCFL1/HDAC1通过K148位点去乙酰化c-Myc，通过抑制K48连接的多泛素化保护c-Myc免受降解
第一步，证明HDAC1的去乙酰化活性调控c-Myc的乙酰化水平构建HDAC1-H141A突变体，进行Co-IP分析，发现突变体对c-Myc的乙酰化水平没有影响（图3a），再次证实HDAC1的去乙酰化活性可以调节c-Myc的乙酰化水平。
第二步，circCFL1调控c-Myc的乙酰化修饰水平
circCFL1被沉默或过表达，检测c-Myc的乙酰化修饰水平，结果发现circCFL1参与c-Myc的乙酰化水平调节（图3b）。这些结果表明circCFL1可能通过HDAC1调节c-Myc蛋白的乙酰化修饰。
第三步，证实circCFL1/HDAC1诱导K148位点c-Myc去乙酰化
利用MusiteDeep (https://www.musite.net/)预测c-Myc蛋白有7个赖氨酸残基(K143、K148、K157、K275、K317、K323和K371) 可能发生乙酰化修饰（图3c）。分别构建K-to-R突变体，进行Co-IP分析，发现HDAC1过表达对c-Myc的K148R突变无显著影响，表明HDAC1对c-Myc的K148位点进行去乙酰化修饰（图3d）。进一步使用circCFL1和HDAC1敲减模型，通过Co-IP 乙酰化检测分析证实circCFL1/HDAC1参与调控c-MycK148位点的去乙酰化修饰（图3e-h）。
第四步，circCFL1/HDAC1诱导的c-Myc去乙酰化可能通过去泛素化来稳定c-Myc蛋白
检测发现，circCFL1/HDAC1轴促进c-Myc蛋白表达（图3i）。MS275处理细胞，显示c-Myc的高乙酰化水平不利于c-Myc蛋白水平的积累，表明c-Myc的乙酰化不利于蛋白的稳定（图3j）。环己亚胺(CHX)处理细胞表明，敲低HDAC1加速c-Myc蛋白的降解，表明HDAC1诱导的c-Myc去乙酰化可以稳定其表达（图3k）。此外，蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，表明HDAC1敲低诱导的c-Myc降解与泛素-蛋白酶体系统相关（图3l）。Co-IP分析显示MS275处理后，c-Myc的泛素化水平显著增加，证明抑制去乙酰化酶活性增强了c-Myc的泛素化水平（图3m）。同时，Co-IP实验发现，HDAC1和circCFL1的敲低或过表达也表明circCFL1/HDAC1轴抑制c-Myc的泛素化（图3n）。此外，Co-IP检测显示HDAC1的H141A突变对泛素化c-Myc的水平没有影响（图3o）。最后，Co-IP实验显示，HDAC1过表达后，c-Myc中K48相关的多泛素水平降低，而K63不降低（图3p）。
结果表明circCFL1/HDAC1轴可以通过c-Myc K148的去乙酰化，从而抑制c-Myc的K48多泛素化降解，从而促进c-
Myc蛋白积累。
图3 circCFL1/HDAC1轴在K148位点去乙酰化c-Myc，通过抑制K48链接的多泛素化保护c-Myc免受降解（Ref. Fig 6/7/S6）
（4）circCFL1/HDAC1/c-Myc轴促进突变体TP53的转录之前的研究结果表明circCFL1的功能与突变型TP53相关。JASPAR分析显示TP53启动子有4个潜在的c-myc结合基序（图3q）。ChIP实验证实所有四个基序都可以结合c-Myc，表明c-Myc与突变体TP53启动子互作（图3r）。双荧光素酶实验证实，circCFL1和HDAC1也可以加速TP53的转录，而TP53可以被c-Myc siRNA抑制（图3s）。证明circCFL1/HDAC1/c-Myc轴控制TP53突变细胞中TP53的转录。
结论：该研究中发现，circCFL1在TNBC细胞和组织中高表达，具有预后潜力。在功能上，circCFL1促进TNBC细胞的增殖、转移和干性。在机制上，circCFL1作为支架分子增强HDAC1与c-Myc互作，通过去乙酰化介导的K48泛素化修饰抑制，进一步增加c-Myc的稳定性。稳定表达的c-Myc直接结合TP53启动子进一步增强mutp53的表达，促进TNBC进展。该研究揭示了circCFL1通过促进HDAC1/c-Myc/mutp53轴发挥致瘤作用，可作为TP53突变TNBC患者的潜在诊断生物标志物和治疗靶点。
