第一步，初步确定OTUD5潜在的底物蛋白
作为去泛素化酶（DUB），OTUD5通过去泛素化底物蛋白起作用。利用IP-MS鉴定潜在的互作蛋白（图1a）。质谱鉴定的前15个潜在结合蛋白中，TAK1被证实在足细胞炎症和DKD进展中具有关键的调节作用（图1b）。因此，假设OTUD5通过去泛素化TAK1在足细胞中负调控炎症和损伤。
第二步，确定TAK1与OTUD5相互作用
内源性Co-IP实验证实，OTUD5与TAK1在细胞和小鼠肾组织均存在相互作用（图1c-d）。同时，外源性Co-IP实验也显示，OTUD5与TAK1相互作用（图1e）。
第三步，OTUD5诱导TAK1 K63连接的去泛素化
Co-IP实验分析显示，OTUD5过表达，降低TAK1的多泛素化水平（图2a）。为了确定TAK1泛素化连接的方式，构建Ub-WT、Ub-K48、Ub-K63和TAK1载体进行Co-IP分析，发现OTUD5降低TAK1的K63连接的泛素化，而不是K48连接的泛素化（图2b）。
第四步，OTUD5通过其活性位点C224切割TAK1的K63连接的泛素化
研究表明，OTU5中的半胱氨酸224残基(C224)为脱泛素活性的必要位点。Co-IP分析显示，与野生型OTUD5相比，催化失活的OTUD5 C224S突变体可以正常与TAK1相互作用（图2c）；但未能从TAK1中去除K63连接的泛素分子（图2d）。表明OTUD5通过其活性位点C224切割TAK1的K63连接的泛素化。
第五步，TAK1的赖氨酸残基K158是OTUD5去泛素化的特异性位点
迄今为止，TAK1蛋白中的四个赖氨酸(Lys)残基K34、K158、K209和K562已被确定为K63连接的多泛素化的潜在位点（图2e）。因此，为了探索哪些赖氨酸残基泛素化可以被OTUD5去除，构建了TAK1位点突变体，包括K34R、K158R、K209R和K562R。Co-IP分析显示，K158R突变体消除了OTUD5介导的去泛素化（图2f）。表明TAK1的赖氨酸残基K158是OTUD5去泛素化的特异性位点。
综上所述，OTUD5通过其活性位点C224降低k63连接的TAK1 K158位点的多泛素化。
更多精彩内容详情可查阅：【《Nat Commun》解读：泛素化修饰影响磷酸化水平。OTUD5通过去泛素化TAK1来缓解糖尿病肾病】。
如有泛素相关机制研究，欢迎留言探讨。
作为去泛素化酶（DUB），OTUD5通过去泛素化底物蛋白起作用。利用IP-MS鉴定潜在的互作蛋白（图1a）。质谱鉴定的前15个潜在结合蛋白中，TAK1被证实在足细胞炎症和DKD进展中具有关键的调节作用（图1b）。因此，假设OTUD5通过去泛素化TAK1在足细胞中负调控炎症和损伤。
第二步，确定TAK1与OTUD5相互作用
内源性Co-IP实验证实，OTUD5与TAK1在细胞和小鼠肾组织均存在相互作用（图1c-d）。同时，外源性Co-IP实验也显示，OTUD5与TAK1相互作用（图1e）。
第三步，OTUD5诱导TAK1 K63连接的去泛素化
Co-IP实验分析显示，OTUD5过表达，降低TAK1的多泛素化水平（图2a）。为了确定TAK1泛素化连接的方式，构建Ub-WT、Ub-K48、Ub-K63和TAK1载体进行Co-IP分析，发现OTUD5降低TAK1的K63连接的泛素化，而不是K48连接的泛素化（图2b）。
第四步，OTUD5通过其活性位点C224切割TAK1的K63连接的泛素化
研究表明，OTU5中的半胱氨酸224残基(C224)为脱泛素活性的必要位点。Co-IP分析显示，与野生型OTUD5相比，催化失活的OTUD5 C224S突变体可以正常与TAK1相互作用（图2c）；但未能从TAK1中去除K63连接的泛素分子（图2d）。表明OTUD5通过其活性位点C224切割TAK1的K63连接的泛素化。
第五步，TAK1的赖氨酸残基K158是OTUD5去泛素化的特异性位点
迄今为止，TAK1蛋白中的四个赖氨酸(Lys)残基K34、K158、K209和K562已被确定为K63连接的多泛素化的潜在位点（图2e）。因此，为了探索哪些赖氨酸残基泛素化可以被OTUD5去除，构建了TAK1位点突变体，包括K34R、K158R、K209R和K562R。Co-IP分析显示，K158R突变体消除了OTUD5介导的去泛素化（图2f）。表明TAK1的赖氨酸残基K158是OTUD5去泛素化的特异性位点。
综上所述，OTUD5通过其活性位点C224降低k63连接的TAK1 K158位点的多泛素化。
更多精彩内容详情可查阅：【《Nat Commun》解读：泛素化修饰影响磷酸化水平。OTUD5通过去泛素化TAK1来缓解糖尿病肾病】。
如有泛素相关机制研究，欢迎留言探讨。
