三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中最恶性、预后最差的亚型。探索TNBC的新型致癌因素和治疗药物仍然是改善预后的重点。四氢姜黄素（THC）是姜黄素（CUR）的主要代谢产物，具有潜在的抗肿瘤活性。但THC在TNBC中的抗肿瘤活性和机制仍不清楚。
2024年11月4日，天津中医药大学康宁/邱峰/张强团队在Journal of Advanced Research（IF=11.4）上发表了题为“Tetrahydrocurcumin targets TRIP13 inhibiting the interaction of TRIP13/USP7/c-FLIP to mediate c-FLIP ubiquitination in triple-negative breast cancer”的研究成果。揭示了TNBC治疗的一种新的策略，并强调了THC等代谢产物的治疗潜力。
图形摘要：
Highlights如下：
1）THC在体外和体内显著抑制TNBC细胞增殖和肿瘤生长；
2）THC通过促进c-FLIP降解来诱导TNBC中的外源性细胞凋亡；
3）TRIP13被确定为THC对抗TNBC的直接目标；
4）TRIP13与USP7和c-FLIP形成三聚体复合物；
5）THC特异性靶向TRIP13破坏TRIP13/USP7/c-FLIP互作，导致c-FLIP泛素化，最终诱导TNBC细胞发生外源性凋亡。功能研究：THC在体外和体内显著抑制TNBC细胞增殖和肿瘤生长。
机制研究：
（1）THC通过抑制c-FLIP诱导细胞凋亡c-FLIP作为细胞凋亡过程中的关键负调控因子，在细胞凋亡通路中起着至关重要的作用。
第一步，THC抑制下游分子c-FLIP的蛋白水平
WB检测显示，THC显著降低TNBC肿瘤组织和细胞中c-FLIP蛋白水平（图1a-b）。功能实验表明，沉默c-FLIP增强了THC在TNBC细胞中的生长抑制作用和凋亡（图1c-e）；而过表达c-FLIP则减弱了这些作用（图1f-h）。表明THC通过抑制TNBC中c-FLIP来诱导细胞凋亡的外源性途径。
第二步，THC主要通过泛素-蛋白酶体途径促进TNBC中c-FLIP的降解
根据RT-qPCR和WB分析显示，THC显著降低TNBC中c-FLIP（基因名：CFLAR）蛋白水平，不影响CFLAR mRNA水平（图1b和1i）。众所周知，细胞内蛋白质降解通常遵循两种主要途径：自噬和泛素-蛋白酶体系统。
研究发现，自噬抑制剂如3-MA、Baf A1和CQ并没有显著改变THC诱导的c-FLIP蛋白表达（图1j）。而蛋白合成抑制剂CHX单独处理导致c-FLIP蛋白水平下降；添加THC后，进一步降低了c-FLIP蛋白水平；重要的是，这种下降可以通过MG132逆转，表明THC通过TNBC细胞中的泛素-蛋白酶体途径促进c-FLIP的降解（图1k）。此外，Co-IP实验分析发现，THC可增强c-FLIP的泛素化（图1l）。表明，THC主要通过泛素-蛋白酶体途径促进TNBC中c-FLIP的降解。
图1 THC通过抑制c-FLIP诱导细胞凋亡（Ref. Fig 2/S6）
（2）THC靶向TRIP13介导c-FLIP泛素化
第一步，筛选与THC结合的潜在靶标TRIP13
为了发现THC的直接细胞靶点，合成THC小分子探针，功能研究发现THC及其探针对TNBC的抗肿瘤作用相似（图2a-c）。利用THC-Probe，结合点击化学反应，在TNBC细胞中进行捕靶实验，拉下的结合蛋白WB结果显示一条50 kDa的明显条带（图2d）。此外，LC-MS/MS和TCGA数据库分析显示，基于TRIP13在乳腺癌与正常组织中的差异表达以及其在蛋白质鉴定指标中的较高可信度评分，TRIP13为候选目标（图2e-f）。SPR分析显示，THC与TRIP13特异性结合（图2g）。随后，CETSA和dart检测结果证实THC与TRIP13结合（图2h-i）。
第二步，验证THC对潜在靶标TRIP13的调控
WB检测显示，THC可显著降低TRIP13的表达，同时，THC进一步增强对TRIP13缺陷细胞的生长抑制（图2j-l）。另外，Co-IP分析显示，THC诱导的c-FLIP泛素化被TRIP13敲减进一步增强（图2m）。表明，THC靶向TRIP13促进c-FLIP的泛素化，从而诱导TNBC的外源性凋亡。
图2 THC靶向TRIP13介导TNBC中c-FLIP泛素化（Ref. Fig 3/S8/S9）
（3）THC结合TRIP13抑制USP7介导的去泛素化，促进c-FLIP的泛素化
第一步，筛选c-FLIP泛素化相关的酶-USP7
TRIP13如何介导c-FLIP的泛素化呢？采用生物信息学方法筛选GO和KEGG数据库中与泛素化相关的条目。利用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络后，分析发现10个核心靶点，包括USP7、USP13、USP14等（图3a）。USP7是一种表征良好的去泛素酶，研究证实，TRIP13可直接与USP7结合，促进其去泛素酶活性。推测TRIP13可能通过USP7调节c-FLIP的水平。此外，分析显示TRIP13、USP7和c-FLIP在TNBC中表达较高，且TRIP13、USP7和c-FLIP呈正相关（图3b）。提示TRIP13、USP7和c-FLIP在TNBC的发生发展中起着至关重要的作用。
第二步，THC通过靶向TRIP13抑制USP7介导的去泛素化，促进c-FLIP的泛素化
THC处理细胞发现，USP7表达的剂量依赖性降低（图3c）。体外去泛素化实验进研究USP7在THC靶向TRIP13介导的c-FLIP泛素化中的作用（图3d），Co-IP分析发现THC促进TNBC中c-FLIP的泛素化，但重组USP7蛋白的加入逆转了THC诱导的c-FLIP泛素化水平（图3e），表明USP7的去泛素化活性降低了c-FLIP的泛素化。此外，重组TRIP13和USP7蛋白的存在进一步降低了c-FLIP的泛素化水平（图3e），表明TRIP13增强了USP7的去泛素化作用。
因此，在THC通过靶向TRIP13介导c-FLIP泛素化的过程中，USP7可能发挥了重要的中介作用。
（4）THC结合TRIP13抑制TRIP13/USP7/c-FLIP三元复合物相互作用介导c-FLIP泛素化
接下来，研究THC处理后TRIP13、c-FLIP和USP7之间的相互作用。Co-IP实验显示c-FLIP、TRIP13和USP7直接结合在一起，THC抑制了它们在TNBC细胞中的结合能力（图3f）。此外，分子对接和分子动力学分析表明，USP7、TRIP13和c-FLIP形成三元配合物，其中TRIP13是连接c-FLIP和USP7的桥梁；THC通过与ASP89和ASP84的氢键与TRIP13相互作用（图3g）。另外，THC的加入削弱了USP7、TRIP13和c-FLIP之间的总结合能和氢键相互作用（图3h-i）。总的来说，TRIP13、USP7和c-FLIP可能以三元配合物的形式存在于TNBC中，THC抑制TRIP13/USP7/c-FLIP复合物的相互作用。
图3 THC结合TRIP13抑制TRIP13/USP7/c-FLIP三元复合物相互作用介导c-FLIP泛素化（Ref. Fig 4/5/S10）
结论：研究人员发现THC在体外和体内均能有效抑制TNBC细胞增殖和肿瘤生长。利用基于点击化学的靶向捕捞，确定TRIP13作为THC对抗TNBC的直接目标。在机制上，THC特异性靶向TRIP13，破坏TRIP13/USP7/c-FLIP三元复合物，导致c-FLIP泛素化增强，最终诱导外源性细胞凋亡。该研究结果为TNBC的治疗提供了一种新的策略，并强调了THC等代谢产物的治疗潜力。
2024年11月4日，天津中医药大学康宁/邱峰/张强团队在Journal of Advanced Research（IF=11.4）上发表了题为“Tetrahydrocurcumin targets TRIP13 inhibiting the interaction of TRIP13/USP7/c-FLIP to mediate c-FLIP ubiquitination in triple-negative breast cancer”的研究成果。揭示了TNBC治疗的一种新的策略，并强调了THC等代谢产物的治疗潜力。
图形摘要：
Highlights如下：
1）THC在体外和体内显著抑制TNBC细胞增殖和肿瘤生长；
2）THC通过促进c-FLIP降解来诱导TNBC中的外源性细胞凋亡；
3）TRIP13被确定为THC对抗TNBC的直接目标；
4）TRIP13与USP7和c-FLIP形成三聚体复合物；
5）THC特异性靶向TRIP13破坏TRIP13/USP7/c-FLIP互作，导致c-FLIP泛素化，最终诱导TNBC细胞发生外源性凋亡。功能研究：THC在体外和体内显著抑制TNBC细胞增殖和肿瘤生长。
机制研究：
（1）THC通过抑制c-FLIP诱导细胞凋亡c-FLIP作为细胞凋亡过程中的关键负调控因子，在细胞凋亡通路中起着至关重要的作用。
第一步，THC抑制下游分子c-FLIP的蛋白水平
WB检测显示，THC显著降低TNBC肿瘤组织和细胞中c-FLIP蛋白水平（图1a-b）。功能实验表明，沉默c-FLIP增强了THC在TNBC细胞中的生长抑制作用和凋亡（图1c-e）；而过表达c-FLIP则减弱了这些作用（图1f-h）。表明THC通过抑制TNBC中c-FLIP来诱导细胞凋亡的外源性途径。
第二步，THC主要通过泛素-蛋白酶体途径促进TNBC中c-FLIP的降解
根据RT-qPCR和WB分析显示，THC显著降低TNBC中c-FLIP（基因名：CFLAR）蛋白水平，不影响CFLAR mRNA水平（图1b和1i）。众所周知，细胞内蛋白质降解通常遵循两种主要途径：自噬和泛素-蛋白酶体系统。
研究发现，自噬抑制剂如3-MA、Baf A1和CQ并没有显著改变THC诱导的c-FLIP蛋白表达（图1j）。而蛋白合成抑制剂CHX单独处理导致c-FLIP蛋白水平下降；添加THC后，进一步降低了c-FLIP蛋白水平；重要的是，这种下降可以通过MG132逆转，表明THC通过TNBC细胞中的泛素-蛋白酶体途径促进c-FLIP的降解（图1k）。此外，Co-IP实验分析发现，THC可增强c-FLIP的泛素化（图1l）。表明，THC主要通过泛素-蛋白酶体途径促进TNBC中c-FLIP的降解。
图1 THC通过抑制c-FLIP诱导细胞凋亡（Ref. Fig 2/S6）
（2）THC靶向TRIP13介导c-FLIP泛素化
第一步，筛选与THC结合的潜在靶标TRIP13
为了发现THC的直接细胞靶点，合成THC小分子探针，功能研究发现THC及其探针对TNBC的抗肿瘤作用相似（图2a-c）。利用THC-Probe，结合点击化学反应，在TNBC细胞中进行捕靶实验，拉下的结合蛋白WB结果显示一条50 kDa的明显条带（图2d）。此外，LC-MS/MS和TCGA数据库分析显示，基于TRIP13在乳腺癌与正常组织中的差异表达以及其在蛋白质鉴定指标中的较高可信度评分，TRIP13为候选目标（图2e-f）。SPR分析显示，THC与TRIP13特异性结合（图2g）。随后，CETSA和dart检测结果证实THC与TRIP13结合（图2h-i）。
第二步，验证THC对潜在靶标TRIP13的调控
WB检测显示，THC可显著降低TRIP13的表达，同时，THC进一步增强对TRIP13缺陷细胞的生长抑制（图2j-l）。另外，Co-IP分析显示，THC诱导的c-FLIP泛素化被TRIP13敲减进一步增强（图2m）。表明，THC靶向TRIP13促进c-FLIP的泛素化，从而诱导TNBC的外源性凋亡。
图2 THC靶向TRIP13介导TNBC中c-FLIP泛素化（Ref. Fig 3/S8/S9）
（3）THC结合TRIP13抑制USP7介导的去泛素化，促进c-FLIP的泛素化
第一步，筛选c-FLIP泛素化相关的酶-USP7
TRIP13如何介导c-FLIP的泛素化呢？采用生物信息学方法筛选GO和KEGG数据库中与泛素化相关的条目。利用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络后，分析发现10个核心靶点，包括USP7、USP13、USP14等（图3a）。USP7是一种表征良好的去泛素酶，研究证实，TRIP13可直接与USP7结合，促进其去泛素酶活性。推测TRIP13可能通过USP7调节c-FLIP的水平。此外，分析显示TRIP13、USP7和c-FLIP在TNBC中表达较高，且TRIP13、USP7和c-FLIP呈正相关（图3b）。提示TRIP13、USP7和c-FLIP在TNBC的发生发展中起着至关重要的作用。
第二步，THC通过靶向TRIP13抑制USP7介导的去泛素化，促进c-FLIP的泛素化
THC处理细胞发现，USP7表达的剂量依赖性降低（图3c）。体外去泛素化实验进研究USP7在THC靶向TRIP13介导的c-FLIP泛素化中的作用（图3d），Co-IP分析发现THC促进TNBC中c-FLIP的泛素化，但重组USP7蛋白的加入逆转了THC诱导的c-FLIP泛素化水平（图3e），表明USP7的去泛素化活性降低了c-FLIP的泛素化。此外，重组TRIP13和USP7蛋白的存在进一步降低了c-FLIP的泛素化水平（图3e），表明TRIP13增强了USP7的去泛素化作用。
因此，在THC通过靶向TRIP13介导c-FLIP泛素化的过程中，USP7可能发挥了重要的中介作用。
（4）THC结合TRIP13抑制TRIP13/USP7/c-FLIP三元复合物相互作用介导c-FLIP泛素化
接下来，研究THC处理后TRIP13、c-FLIP和USP7之间的相互作用。Co-IP实验显示c-FLIP、TRIP13和USP7直接结合在一起，THC抑制了它们在TNBC细胞中的结合能力（图3f）。此外，分子对接和分子动力学分析表明，USP7、TRIP13和c-FLIP形成三元配合物，其中TRIP13是连接c-FLIP和USP7的桥梁；THC通过与ASP89和ASP84的氢键与TRIP13相互作用（图3g）。另外，THC的加入削弱了USP7、TRIP13和c-FLIP之间的总结合能和氢键相互作用（图3h-i）。总的来说，TRIP13、USP7和c-FLIP可能以三元配合物的形式存在于TNBC中，THC抑制TRIP13/USP7/c-FLIP复合物的相互作用。
图3 THC结合TRIP13抑制TRIP13/USP7/c-FLIP三元复合物相互作用介导c-FLIP泛素化（Ref. Fig 4/5/S10）
结论：研究人员发现THC在体外和体内均能有效抑制TNBC细胞增殖和肿瘤生长。利用基于点击化学的靶向捕捞，确定TRIP13作为THC对抗TNBC的直接目标。在机制上，THC特异性靶向TRIP13，破坏TRIP13/USP7/c-FLIP三元复合物，导致c-FLIP泛素化增强，最终诱导外源性细胞凋亡。该研究结果为TNBC的治疗提供了一种新的策略，并强调了THC等代谢产物的治疗潜力。
