大家好，今天跟大家分享一篇题为Introducing synthetic thermostable RNase inhibitorsto single-cell RNA-seg（将合成的耐热RNase抑制剂引入单细胞RNA片段）单细胞 RNA 测序 （scRNAseq） 正在彻底改变生物医学，这得益于单细胞测序的易用性和低成本文库制备。因为细胞中存在的单个转录本的拷贝数极小，所以scRNAseq 要特别注意 RNA 的降解和丢失。
01
研究背景
单细胞 RNA 测序 （scRNAseq） 正在彻底改变生物医学，这得益于方法学的进步、易用性和文库制备成本的降低。在过去的十年中，单细胞转录组学的大多数方面都取得了显着的技术进步。然而，尽管在细胞收集、储存和 cDNA 文库生成过程中保持 RNA 完整性至关重要，但在推进 RNase 抑制方面几乎没有取得进展。
在这里，我们证明，与普遍使用的基于蛋白质的重组 RNase 抑制剂 （RRI） 相比，合成热稳定 RNase 抑制剂 （SEQURNA） 产生相同或更优质质量的单细胞文库。重要的是，合成的 RNase 抑制剂在重现性和通量方面提供了额外的独特改进，实现了新的实验工作流程，包括在整个热循环中保留 RNase 抑制，并且可以减少对干冰运输的需求。总之，替代 RRI 代表了单细胞转录组学领域的重大进步。
见图一
在微型批量 RNA-seq 文库生成中用合成热稳定 RNase 抑制剂替换 RRI。
图一
a 生物分析仪使用不同浓度的 SEQURNA （0–18 U/μl） 或标准重组 RNase 抑制剂 （RRI） 在裂解缓冲液中从 100 pg 小鼠 RNA 生成的 Smart-seq2 （SS2） cDNA 文库的痕迹。x 轴上的刻度线对应于 35、100、300、500、1000、3000 和 10380 个碱基对。
b 定量大量 SS2 cDNA 文库的 cDNA 产量（片段大小 200–10,000 bp）。裂解缓冲液中的 SEQURNA 浓度位于下部 x 轴上部，RT 中的浓度位于上部 x 轴上部。数据显示为平均值 （点） 和标准误差 （线）。n = 每个条件 2-8 条跟踪（分析 54 条跟踪）。
c （b） 中样品的 SS2 大量 cDNA 文库（片段大小 20–50 bp）中的引物二聚体百分比。
d 使用 eGFP 质粒作为模板并在 PCR 过程中改变 SEQURNA 浓度形成的产物的凝胶电泳图像。脱靶、靶标和二聚体条带分别用蓝色、橙色和绿色箭头表示。M = 标记梯子。
e 使用人 gDNA 作为模板和五个靶向 TUBA1A 的引物组形成的产物的凝胶电泳图像。脱靶条带和靶条带分别以蓝色和橙色表示。
M = 标记梯子。从 100 pg 小鼠 RNA 生成的 SS2 文库的唯一映射测序读数百分比 （f） 和检测到的基因数量 （g） 的箱形图。数据显示为中位数、四分位距 （IQR） 和 1.5x IQR，每个条件 n = 5-35 个重复（总计 = 195）。h 对于大量 SS2 文库，映射到小鼠基因组的外显子（橙色）、内含子（蓝色）或基因间（绿色）区域的分数读数的堆叠条形图。数据显示为平均值，线条表示标准误差。i 对于大量 SS2 文库，沿与参考转录本匹配的测序读数的碱基分数的线图，表明读取质量。
j 大量 SS2 文库沿转录本的归一化覆盖度的线图。源数据中提供了相关图的基础数据，补充数据 1 中提供了用于统计比较的 P 值。
见图二
SEQURNA 在单细胞 Smart-seq2 中的性能。
图二
a 生物分析仪使用不同浓度的 SEQURNA 浓度 （0–24 U/μl） 或标准重组 RNase 抑制剂 （RRI） 在裂解缓冲液中对HEK293FT单个细胞的 Smart-seq2 （SS2） cDNA 文库进行追踪。x 轴上的刻度线对应于 35、100、300、500、1000、3000 和 10380 个碱基对。
b 定量HEK293FT细胞中单细胞 SS2 cDNA 文库的 cDNA 产量（片段大小 200–10,000 bp）。裂解缓冲液中的 SEQURNA 浓度位于下部 x 轴上部，RT 中的浓度位于上部 x 轴上部。数据显示为平均值 （点） 和标准误差 （线）。n = 每个条件 3-6 条跟踪（分析 50 条跟踪）。
c （b） 中样品中来自HEK293FT细胞的单细胞 SS2 cDNA 文库（片段大小 20-50 bp）的引物二聚体百分比。
d 在单细胞 SS2 文库中检测到HEK293FT基因数量的箱形图。数据显示为中位数、四分位距 （IQR） 和 1.5 倍 IQR。每个条件 n = 37–94（分析 704 个文库）。
e 映射到单细胞 SS2 文库的人类基因组外显子（橙色）、内含子（蓝色）或基因间（绿色）区域的分数读数HEK293FT堆积条形图。数据显示为平均值，线条表示标准误差，每个条件 n = 37–94。
f 单细胞HEK293FT SS2 文库沿转录本的归一化覆盖度线图，每个条件 n = 37–94。
g 来源于肝脏（n = 349 个细胞）和脾脏（n = 368 个细胞）组织的小鼠细胞中单细胞 SS2 文库的均匀流形近似和投影 （UMAP）。对小细胞大小的细胞进行门控，以富集低 RNA 含量的细胞（补充图 D）。5）. 颜色表示组织来源于肝脏（蓝色）或脾脏（橙色）（左），SEQURNA 浓度 3.0 U/μl（浅绿色）、4.5 U/μl（深绿色）或 RRI（紫色）（中）和细胞类型识别为 B 细胞（蓝色）、T 细胞（红色）、肝细胞（绿色）或单核细胞（紫色）（右）。源数据中提供了相关图的基础数据，补充数据 1 中提供了用于统计比较的 P 值。
见图三
SEQURNA 在小型散装和单细胞 Smart-seq 中的性能3。
图三
a 生物分析仪使用不同浓度的 SEQURNA 浓度 （0–9 U/μl） 或标准 SS3 重组 RNase 抑制剂 （RRI） 在裂解缓冲液中从 100 pg 小鼠 RNA（散装）生成的 Smart-seq3 （SS3） cDNA 文库的痕迹。x 轴上的刻度线对应于 35、100、300、500、1000、3000 和 10380 个碱基对。
b 定量的大量 SS3 cDNA 文库的 cDNA 产量（片段大小 200–10,000 bp）。数据显示为平均值 （点） 和标准误差 （线）。n = 每个条件 3-5 条跟踪（分析 51 条跟踪）。
c 在裂解缓冲液中使用不同 SEQURNA 浓度（0.15、0.3、0.6 U/μL）或标准 SS3 RRI 对HEK293FT细胞的单细胞 SS3 cDNA 文库进行生物分析仪分析。
d 定量HEK293FT细胞中单细胞 SS3 cDNA 文库的 cDNA 产量（片段大小 200–10,000 bp）。数据显示为平均值 （点） 和标准误差 （线）。n = 每个条件 11–14 条跟踪（分析 53 条跟踪）。
e 在 SS3 文库中检测到的 100 pg 小鼠大量 RNA（左，每个条件 n = 7-16 个文库，总数 = 170）和单细胞HEK293FT（右，每个条件 n = 31-45 个细胞，总数 = 158）的基因数。数据显示为中位数、四分位距 （IQR） 和 1.5 倍 IQR。
f 单细胞 HEK293FT SS3 文库映射到人类基因组的外显子（橙色）、内含子（蓝色）或基因间（绿色）区域的分数读数的堆叠条形图。数据显示为平均值，线条表示标准误差。n = 每个条件 31–45 个细胞。单细胞HEK293FT SS3 文库沿转录本的归一化覆盖的 g 线图，特征偏向于包含 5′-UMI 的末端。n = 每个条件 31–45 个细胞。
h 在 SS3 文库中检测到的 100 pg 小鼠大量 RNA（左，每个条件 n = 7-16 个样品）和单细胞HEK293FT（右，每个条件 n = 31-45 个细胞）的唯一分子标识符 （UMI） 数量的箱形图。源数据中提供了相关图的基础数据，补充数据 1 中提供了用于统计比较的 P 值。
见图四
Smart-seq3xpress 单细胞文库在 SEQURNA 裂解缓冲液中长期储存后的特性。
图四
a 生物分析仪追踪了 HEK293FT 单细胞 cDNA 的 Tn5 矽碎和扩增文库，这些文库在马tagmentation反应中改变了 SEQURNA 浓度。X 轴刻度对应于 35、100、300、500、1000、3000 和 10380 个碱基对。
b （a） 中文库的量化文库产量。数据显示为每个条件的平均值±标准误差 n = 9（共 72 个）。
c 在不含抑制剂 （0 U/μL）、SEQURNA （0.06、0.15、0.3、0.6、1.5 或 3.0 U/μL） 或标准 SS3xpress 重组 RNase 抑制剂 （RRI） 的 SS3xpress 裂解缓冲液中收集的 HEK293FT 细胞的 Smart-seq3xpress 文库中检测到的基因数量的箱形图。每个条件 n = 88–96 个细胞，总计 = 757（仅限第 0 天）。
d 映射到对应于 （c） 中细胞的单细胞 SS3xpress 的外显子（橙色）、内含子（蓝色）或基因间（绿色）区域的读数HEK293FT堆积条形图。数据显示为平均值±标准误差。
e 对应于 （c） 中单元格的唯一分子标识符 （UMI） 数量的箱形图。
f 在裂解缓冲液中HEK293FT SS3xpress 改变 RNase 抑制剂条件并在 25 °C 下储存细胞 0、1、4 或 7 天时检测到的基因数量的箱形图。n = 第 0 天每个条件 57-93 个细胞，第 1-7 天每个条件 n = 6-48 个细胞，总计 = 1220。
g 检测到的对应于 （f） 中单元格的 UMI 数量的箱形图。
h 在裂解缓冲液中HEK293FT单细胞 SS3xpress 不同的 RNase 抑制剂条件下检测到的基因数量的箱形图，并在 4 °C 下储存细胞 0、1、4、7 或 14 天。n = 第 0 天每个条件 57-96 个细胞，第 1-7 天每个条件 n = 11-48 个细胞，总计 = 1448。i 检测到的 UMI 数的箱形图对应于 （h） 中的单元格。
c、e-i 数据显示为中位数、四分位距 （IQR） 和 1.5 倍 IQR。f-i 数据下采样至每个细胞 100,000 个读数（3456 个细胞在下采样前测序），红线表示 RRI 的中位数。源数据中提供了相关图的基础数据，补充数据 1 中提供了用于统计比较的 P 值。
02
研究结论
此外，我们还设想合成 RNase 抑制剂在需要大液体量和高抑制剂消耗量的应用中将非常有益，这可以促进组织或整个生物体中的原位 RNA 测序。总之，用合成的热稳定 RNAse 抑制剂替代 RRI 代表了单细胞转录组学发展的一个里程碑。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
01
研究背景
单细胞 RNA 测序 （scRNAseq） 正在彻底改变生物医学，这得益于方法学的进步、易用性和文库制备成本的降低。在过去的十年中，单细胞转录组学的大多数方面都取得了显着的技术进步。然而，尽管在细胞收集、储存和 cDNA 文库生成过程中保持 RNA 完整性至关重要，但在推进 RNase 抑制方面几乎没有取得进展。
在这里，我们证明，与普遍使用的基于蛋白质的重组 RNase 抑制剂 （RRI） 相比，合成热稳定 RNase 抑制剂 （SEQURNA） 产生相同或更优质质量的单细胞文库。重要的是，合成的 RNase 抑制剂在重现性和通量方面提供了额外的独特改进，实现了新的实验工作流程，包括在整个热循环中保留 RNase 抑制，并且可以减少对干冰运输的需求。总之，替代 RRI 代表了单细胞转录组学领域的重大进步。
见图一
在微型批量 RNA-seq 文库生成中用合成热稳定 RNase 抑制剂替换 RRI。
图一
a 生物分析仪使用不同浓度的 SEQURNA （0–18 U/μl） 或标准重组 RNase 抑制剂 （RRI） 在裂解缓冲液中从 100 pg 小鼠 RNA 生成的 Smart-seq2 （SS2） cDNA 文库的痕迹。x 轴上的刻度线对应于 35、100、300、500、1000、3000 和 10380 个碱基对。
b 定量大量 SS2 cDNA 文库的 cDNA 产量（片段大小 200–10,000 bp）。裂解缓冲液中的 SEQURNA 浓度位于下部 x 轴上部，RT 中的浓度位于上部 x 轴上部。数据显示为平均值 （点） 和标准误差 （线）。n = 每个条件 2-8 条跟踪（分析 54 条跟踪）。
c （b） 中样品的 SS2 大量 cDNA 文库（片段大小 20–50 bp）中的引物二聚体百分比。
d 使用 eGFP 质粒作为模板并在 PCR 过程中改变 SEQURNA 浓度形成的产物的凝胶电泳图像。脱靶、靶标和二聚体条带分别用蓝色、橙色和绿色箭头表示。M = 标记梯子。
e 使用人 gDNA 作为模板和五个靶向 TUBA1A 的引物组形成的产物的凝胶电泳图像。脱靶条带和靶条带分别以蓝色和橙色表示。
M = 标记梯子。从 100 pg 小鼠 RNA 生成的 SS2 文库的唯一映射测序读数百分比 （f） 和检测到的基因数量 （g） 的箱形图。数据显示为中位数、四分位距 （IQR） 和 1.5x IQR，每个条件 n = 5-35 个重复（总计 = 195）。h 对于大量 SS2 文库，映射到小鼠基因组的外显子（橙色）、内含子（蓝色）或基因间（绿色）区域的分数读数的堆叠条形图。数据显示为平均值，线条表示标准误差。i 对于大量 SS2 文库，沿与参考转录本匹配的测序读数的碱基分数的线图，表明读取质量。
j 大量 SS2 文库沿转录本的归一化覆盖度的线图。源数据中提供了相关图的基础数据，补充数据 1 中提供了用于统计比较的 P 值。
见图二
SEQURNA 在单细胞 Smart-seq2 中的性能。
图二
a 生物分析仪使用不同浓度的 SEQURNA 浓度 （0–24 U/μl） 或标准重组 RNase 抑制剂 （RRI） 在裂解缓冲液中对HEK293FT单个细胞的 Smart-seq2 （SS2） cDNA 文库进行追踪。x 轴上的刻度线对应于 35、100、300、500、1000、3000 和 10380 个碱基对。
b 定量HEK293FT细胞中单细胞 SS2 cDNA 文库的 cDNA 产量（片段大小 200–10,000 bp）。裂解缓冲液中的 SEQURNA 浓度位于下部 x 轴上部，RT 中的浓度位于上部 x 轴上部。数据显示为平均值 （点） 和标准误差 （线）。n = 每个条件 3-6 条跟踪（分析 50 条跟踪）。
c （b） 中样品中来自HEK293FT细胞的单细胞 SS2 cDNA 文库（片段大小 20-50 bp）的引物二聚体百分比。
d 在单细胞 SS2 文库中检测到HEK293FT基因数量的箱形图。数据显示为中位数、四分位距 （IQR） 和 1.5 倍 IQR。每个条件 n = 37–94（分析 704 个文库）。
e 映射到单细胞 SS2 文库的人类基因组外显子（橙色）、内含子（蓝色）或基因间（绿色）区域的分数读数HEK293FT堆积条形图。数据显示为平均值，线条表示标准误差，每个条件 n = 37–94。
f 单细胞HEK293FT SS2 文库沿转录本的归一化覆盖度线图，每个条件 n = 37–94。
g 来源于肝脏（n = 349 个细胞）和脾脏（n = 368 个细胞）组织的小鼠细胞中单细胞 SS2 文库的均匀流形近似和投影 （UMAP）。对小细胞大小的细胞进行门控，以富集低 RNA 含量的细胞（补充图 D）。5）. 颜色表示组织来源于肝脏（蓝色）或脾脏（橙色）（左），SEQURNA 浓度 3.0 U/μl（浅绿色）、4.5 U/μl（深绿色）或 RRI（紫色）（中）和细胞类型识别为 B 细胞（蓝色）、T 细胞（红色）、肝细胞（绿色）或单核细胞（紫色）（右）。源数据中提供了相关图的基础数据，补充数据 1 中提供了用于统计比较的 P 值。
见图三
SEQURNA 在小型散装和单细胞 Smart-seq 中的性能3。
图三
a 生物分析仪使用不同浓度的 SEQURNA 浓度 （0–9 U/μl） 或标准 SS3 重组 RNase 抑制剂 （RRI） 在裂解缓冲液中从 100 pg 小鼠 RNA（散装）生成的 Smart-seq3 （SS3） cDNA 文库的痕迹。x 轴上的刻度线对应于 35、100、300、500、1000、3000 和 10380 个碱基对。
b 定量的大量 SS3 cDNA 文库的 cDNA 产量（片段大小 200–10,000 bp）。数据显示为平均值 （点） 和标准误差 （线）。n = 每个条件 3-5 条跟踪（分析 51 条跟踪）。
c 在裂解缓冲液中使用不同 SEQURNA 浓度（0.15、0.3、0.6 U/μL）或标准 SS3 RRI 对HEK293FT细胞的单细胞 SS3 cDNA 文库进行生物分析仪分析。
d 定量HEK293FT细胞中单细胞 SS3 cDNA 文库的 cDNA 产量（片段大小 200–10,000 bp）。数据显示为平均值 （点） 和标准误差 （线）。n = 每个条件 11–14 条跟踪（分析 53 条跟踪）。
e 在 SS3 文库中检测到的 100 pg 小鼠大量 RNA（左，每个条件 n = 7-16 个文库，总数 = 170）和单细胞HEK293FT（右，每个条件 n = 31-45 个细胞，总数 = 158）的基因数。数据显示为中位数、四分位距 （IQR） 和 1.5 倍 IQR。
f 单细胞 HEK293FT SS3 文库映射到人类基因组的外显子（橙色）、内含子（蓝色）或基因间（绿色）区域的分数读数的堆叠条形图。数据显示为平均值，线条表示标准误差。n = 每个条件 31–45 个细胞。单细胞HEK293FT SS3 文库沿转录本的归一化覆盖的 g 线图，特征偏向于包含 5′-UMI 的末端。n = 每个条件 31–45 个细胞。
h 在 SS3 文库中检测到的 100 pg 小鼠大量 RNA（左，每个条件 n = 7-16 个样品）和单细胞HEK293FT（右，每个条件 n = 31-45 个细胞）的唯一分子标识符 （UMI） 数量的箱形图。源数据中提供了相关图的基础数据，补充数据 1 中提供了用于统计比较的 P 值。
见图四
Smart-seq3xpress 单细胞文库在 SEQURNA 裂解缓冲液中长期储存后的特性。
图四
a 生物分析仪追踪了 HEK293FT 单细胞 cDNA 的 Tn5 矽碎和扩增文库，这些文库在马tagmentation反应中改变了 SEQURNA 浓度。X 轴刻度对应于 35、100、300、500、1000、3000 和 10380 个碱基对。
b （a） 中文库的量化文库产量。数据显示为每个条件的平均值±标准误差 n = 9（共 72 个）。
c 在不含抑制剂 （0 U/μL）、SEQURNA （0.06、0.15、0.3、0.6、1.5 或 3.0 U/μL） 或标准 SS3xpress 重组 RNase 抑制剂 （RRI） 的 SS3xpress 裂解缓冲液中收集的 HEK293FT 细胞的 Smart-seq3xpress 文库中检测到的基因数量的箱形图。每个条件 n = 88–96 个细胞，总计 = 757（仅限第 0 天）。
d 映射到对应于 （c） 中细胞的单细胞 SS3xpress 的外显子（橙色）、内含子（蓝色）或基因间（绿色）区域的读数HEK293FT堆积条形图。数据显示为平均值±标准误差。
e 对应于 （c） 中单元格的唯一分子标识符 （UMI） 数量的箱形图。
f 在裂解缓冲液中HEK293FT SS3xpress 改变 RNase 抑制剂条件并在 25 °C 下储存细胞 0、1、4 或 7 天时检测到的基因数量的箱形图。n = 第 0 天每个条件 57-93 个细胞，第 1-7 天每个条件 n = 6-48 个细胞，总计 = 1220。
g 检测到的对应于 （f） 中单元格的 UMI 数量的箱形图。
h 在裂解缓冲液中HEK293FT单细胞 SS3xpress 不同的 RNase 抑制剂条件下检测到的基因数量的箱形图，并在 4 °C 下储存细胞 0、1、4、7 或 14 天。n = 第 0 天每个条件 57-96 个细胞，第 1-7 天每个条件 n = 11-48 个细胞，总计 = 1448。i 检测到的 UMI 数的箱形图对应于 （h） 中的单元格。
c、e-i 数据显示为中位数、四分位距 （IQR） 和 1.5 倍 IQR。f-i 数据下采样至每个细胞 100,000 个读数（3456 个细胞在下采样前测序），红线表示 RRI 的中位数。源数据中提供了相关图的基础数据，补充数据 1 中提供了用于统计比较的 P 值。
02
研究结论
此外，我们还设想合成 RNase 抑制剂在需要大液体量和高抑制剂消耗量的应用中将非常有益，这可以促进组织或整个生物体中的原位 RNA 测序。总之，用合成的热稳定 RNAse 抑制剂替代 RRI 代表了单细胞转录组学发展的一个里程碑。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
