实时荧光定量逆转录PCR（real-time quantitative reverse transcription PCR，简称RT-qPCR）是一种在PCR实验中，以RNA为起始材料的检测技术。此方法首先利用逆转录酶，将总RNA或信使RNA（mRNA）转录成互补DNA（cDNA）。
接着，以生成的cDNA作为模板，进行实时荧光定量PCR反应。RT-qPCR技术已广泛应用于分子生物学的多个领域，如基因表达水平分析、RNA干扰效果验证、微阵列数据验证、病原体筛查、基因诊断以及疾病相关研究。
RT-qPCR的两种实施方式：一步法与两步法
一步法RT-qPCR将逆转录与PCR扩增步骤合并，使得逆转录酶与DNA聚合酶在同一反应管中，于相同缓冲液环境下进行反应。此方法仅需使用序列特异性引物即可。
而两步法RT-qPCR则是将逆转录与PCR扩增分别在不同的反应管中进行，两者采用各自优化的缓冲液、反应条件以及引物设计方案。
一步法的优点包括：
1. 由于两步反应在同一管内完成，减少了实验误差的可能性；
2. 减少了移液步骤，从而降低了污染的风险；
3. 适用于高通量的扩增与筛选，操作迅速且结果可重复性好。
一步法的缺点包括：
1. 无法对两步反应进行独立优化；
2. 反应条件需兼顾两步反应，导致灵敏性相对较低；
3. 单次检测能覆盖的靶点数有限。
两步法的优点包括：
1. 能够构建稳定的cDNA库，便于长期保存并多次使用；
2. 靶基因与内参基因可从同一cDNA库中扩增，避免了多重cDNA库的使用；
3. 可针对单一反应过程优化反应缓冲液和条件；
4. 引物设计更加灵活。
两步法的缺点包括：
1. 使用多个试管及增加移液步骤会提高DNA污染的风险，并延长操作时间；
2. 相较于一步法，两步法需要更多的优化工作。