大家好，今天跟大家分享一篇2024年9月16日，中山大学生命科学学院金寿恒副教授在国际期刊 The EMBO Journal 上在线发表了题为 ER-phagy restrains inflam matory responses through its receptor UBAC2 的研究论文，该研究鉴定出UBAC2 蛋白作为 ER - phagy 的新受体，当细胞处于 ER 应激或自噬激活的状态时，MARK2使 UBAC2 磷酸化并二聚化，进而增强其与GABARAP的相互作用，从而促进了内质网的选择性降解。
01
研究背景
内质网自噬是内质网 （ER） 片段自噬降解的一种选择性形式，在调节内质网稳态中起着重要作用。内质网自噬失调与未折叠蛋白反应 （UPR） 有关，这是诱发炎症性疾病的主要线索。然而，支撑 ER 自噬与疾病之间联系的分子机制仍然不清楚。在这里，我们确定了泛素相关结构域蛋白 2 （UBAC2） 是 ER 自噬的受体，同时是炎症反应的负调节因子。
UBAC2 在其细胞质结构域中包含一个经典的 LC3 相互作用区域 （LIR），该区域与自噬体 GABARAP 结合。在 ER 应激或自噬激活时，微管亲和调节激酶 2 （MARK2） 在丝氨酸 （S） 223 位点磷酸化 UBAC2，促进其二聚化。二聚化 UBAC2 与 GABARAP 的相互作用更强，从而促进 ER 的选择性降解。
此外，通过影响 ER 噬，UBAC2 抑制小鼠的炎症反应和急性溃疡性结肠炎 （UC）。我们的研究结果表明，由 MARK2-UBAC2 轴指导的 ER 自噬可能为炎症性疾病的治疗提供靶点。
见图一
UBAC2 可以通过自噬过程降解。
图一
(A） ERM-PhastID 屏幕示意图。
（B） 表达 ERM-PhastID 的 HeLa 细胞用或不用 thapsigargin （TG） （1 μM） 处理 2 h，并在生物素 （50 μM） 中培养 1 h。通过链霉亲和素包被的珠子收集生物素化蛋白，并使用质谱 （MS） 进行鉴定。该实验进行一次，每个条件重复两次。
（C） 表达 ERM-PhastID 的 HeLa 细胞中 UBAC2 的 mRNA 水平，用或不用 TG （1 μM） 处理 3 小时。
（D） 在不存在或存在 TG （1 μM） 的情况下培养 3 小时的 HeLa 细胞用 MG132 （10 μM）、卡非佐米 （10 μM） 或巴弗洛霉素 A1 （0.2 μM） 处理 6 小时。通过免疫印迹分析细胞提取物。
（E） 与（D） 相似样品中 UBAC2 蛋白丰度的定量，来自三个独立实验，一式两份。
（F） 在不存在或存在 Baf A1 （0.2 μM） 的情况下，用指定剂量的 TG 处理 HeLa 细胞 3 h，并收集蛋白质进行免疫印迹分析。
（G） 与 （F） 相似样品中 UBAC2 的 mRNA 水平。（H） HeLa 细胞在 EBSS 中培养指定时间点，有或没有 Baf A1 （0.2 μM） 处理，并通过免疫印迹检测裂解物。
（I） 对在 EBSS 中培养的指定时间点的野生型 （WT） 和 BECN1 KO 293 T 细胞的裂解物进行免疫印迹分析。
（J） 在不存在或存在 EBSS 的情况下，在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下培养 3 小时的 HeLa 细胞，然后用特异性抗体标记 UBAC2（绿色）和 WIPI2（红色）。比例尺，20 μm。
（K） 对来自三个生物学独立实验的与 （J） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（L） 在不存在或存在 EBSS 的情况下，在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下培养 3 小时的 HeLa 细胞，然后用特异性抗体标记 UBAC2（绿色）和 ATG16L1（红色）。比例尺，20 μm。
（M） 对来自三个生物学独立实验的与 （L） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（N） 在不存在或存在 EBSS 的情况下，在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下培养 3 小时的 HeLa 细胞，然后用特异性抗体标记 UBAC2（绿色）和 LAMP1（红色）。比例尺，20 μm。
（O） 对来自三个生物学独立实验的与 （N） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。数据信息：对于 （D， F， H–J， L， N），显示了三个实验中的一个。在 （C， E， G， K， M， O） 中，数据表示为三个独立生物实验的平均 ± SEM。采用未配对的双尾 Student's t 检验分析差异的统计学意义，并显示 P 值。此图的源数据可在线获取。
见图二UBAC2 通过其 LIR 与 GABARAP 交互。
图二
(A） 用编码 HA-UBAC2 和 Flag 标记的 ATG8 家族成员（Flag-LC3A、Flag-LC3B、Flag-LC3C、Flag-GABARAP、Flag-GABARAPL1 和 Flag-GABARAPL2）的质粒转染HEK293T细胞，然后用抗 Flag 珠进行免疫沉淀 （IP） 和用抗 HA 进行免疫印迹分析。整个过程是无免疫沉淀的全细胞裂解物 （WCL） 的免疫印迹分析。
（B、C）使用抗 GABARAP 进行免疫沉淀，并使用指定抗体对与 TG （1 μM） （B） 或 EBSS （C） 孵育不同时间的 HeLa 细胞提取物进行免疫沉淀。
（D） 在不存在或存在 EBSS 的情况下，在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下培养 3 小时的 HeLa 细胞，然后用特异性抗体标记 UBAC2（绿色）和 GABARAP（红色）。比例尺，20 μm。显示了三个实验中的一个代表性实验。
（E） 对来自三个生物学独立实验的与 （D） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（F） 人 UBAC2 的结构，描绘了已鉴定的 LC3 相互作用区域 （LIR）。
（G） 对转染编码 Flag-GABARAP 和野生型 （WT） HA-UBAC2 或其 LIR 突变体 （LIRm） 的载体的 293 个 T 细胞进行免疫沉淀和免疫印迹分析。
（H） 在 EBSS 存在下用 Flag-UBAC2 或其 LIRm 形式转染 HeLa 细胞 3 小时，同时存在 Baf A1 （0.2 μM），然后用特异性抗体标记 Flag（绿色）和 GABARAP（红色）。比例尺，20 μm。
（I） 对来自三个生物学独立实验的与 （H） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（J） 分别从大肠杆菌中表达和纯化 His-GFP-UBAC2 和 His-GABARAP。通过 SDS-PAGE 分析蛋白质纯度，并通过考马斯蓝染色 （CBS） 进行可视化。将 His-GFP-UBAC2 与 His-GABARAP 在体外反应缓冲液中孵育。用 GFP 珠子下拉后，通过免疫印迹分析结合的材料。
（K） 用编码 Flag-UBAC2 LIRm 的质粒转染 293T 细胞，然后在 EBSS 中培养指定时间点，有或没有 Baf A1 （0.2 μM）。免疫印迹法检测 UBAC2 蛋白表达水平。
（L） 在 EBSS 存在下用 GFP-UBAC2 或其 LIRm 形式转染 HeLa 细胞 3 小时，存在 Baf A1 （0.2 μM），然后用特异性抗体标记 LAMP1（红色）。比例尺，20 μm。（M） 与 （L） 相似样品的定量分析。
（N） 分别从大肠杆菌中表达和纯化 His-GFP-UBAC2 和 His-GABARAP 及其指示的突变体。GFP-UBAC2 与 His-GABARAP 在体外反应缓冲液中孵育。用 GFP 珠子下拉后，通过免疫印迹分析结合的材料。数据信息：对于 （A–D， G， H， J–L， N），显示了三个实验中的一个。在 （E， I， M） 中，数据表示为三个独立生物实验的平均 ± SEM。采用未配对的双尾 Student's t 检验分析差异的统计学意义，并显示 P 值。此图的源数据可在线获取。
见图三
UBAC2 是一种 ER 自噬受体。
图三
(A） ER 自噬报告基因 ss-RFP-GFP-KDEL 的示意图。ss-RFP-GFP-KDEL 被溶酶体酶裂解以产生 RFP 片段。GFP 信号在溶酶体中被淬灭。SS，信号序列。
（B） 稳定表达 ER 自噬报告基因的 WT 和 UBAC2 KO HeLa 细胞在多西环素 （Dox） （200 ng/mL） 存在下培养 24 小时以诱导报告基因。用 EBSS 培养指定时间点后，收获蛋白质用于免疫印迹分析。
（C） 量化 RFP 和 RFP-GFP 的谱带强度，并显示 RFP/RFP-GFP 的比率。
（D） 稳定表达 ER 自噬报告基因的 WT 或 UBAC2 KO HeLa 细胞用 Dox （200 ng/mL） 处理 24 小时。在 EBSS 中培养 3 小时后，处理细胞并通过荧光显微镜观察。比例尺，20 μm。
（E） 对来自三个生物学独立实验的与 （D） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（F） 通过免疫印迹分析在 EBSS 中培养的 WT 或 UBAC2 KO HeLa 细胞的裂解物。
（G） 用编码 WT 或 LIRm UBAC2 的质粒转染稳定表达 ER 自噬报告基因的 HeLa 细胞，并用 Dox （200 ng/mL） 处理 24 h。在 EBSS 中培养 3 小时后，通过荧光显微镜观察细胞。比例尺，20 μm。（H） 对来自三个生物学独立实验的与 （G） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（I） 用表达 WT UBAC2 或 UBAC2 LIRm 的质粒转染的 HeLa 细胞在正常培养基或 EBSS 中培养 3 小时。收获裂解物用于免疫印迹分析。
（J） 转染 Flag-UBAC2 载体或其 LIRm 并用 EBSS 处理 3 小时的 WT 和 UBAC2 KO HeLa 细胞的透射电子显微镜检查。ER 由黑色箭头指示。比例尺，200 nm。
（K） 在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下与 EBSS 一起孵育 3 h 的 HeLa 细胞提取物，用抗 UBAC2 进行免疫沉淀，并使用指定抗体进行免疫印迹分析。
（L） 稳定表达 ER 自噬报告基因的 HeLa 细胞，用在 Dox （200 ng/mL） 存在下培养的加扰、FAM134B 或 UBAC2 特异性 siRNA 转染 24 小时以诱导报告基因。用 EBSS 处理 3 小时后。收集裂解物用于免疫印迹分析。数据信息：对于 （B， D， F， G， I–L），显示了三个实验中的一个。在 （C， E， H） 中，数据表示为三个独立生物实验的平均 ± SEM。采用未配对的双尾 Student's t 检验分析差异的统计学意义，并显示 P 值。此图的源数据可在线获取。
见图四
S223 位点的 UBAC2 磷酸化对其在 ER 自噬中的作用至关重要。
图四
(A） 质谱分析确定了 UBAC2 上丝氨酸 223 位点的磷酸化位点。
（B） 使用磷酸丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸多克隆抗体对指定时间点用 TG （1 μM） 处理的 HeLa 细胞提取物进行免疫沉淀，并用 UBAC2 抗体进行免疫印迹。
（C） 在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下，用 TG （1 μM） 处理转染 Flag-UBAC2 载体或其 S223A 突变体的 293T 细胞 1 小时。对裂解物进行免疫共沉淀和免疫印迹分析。
（D） 对转染 Flag-UBAC2 和 HA-UBAC2 质粒的 293T 细胞裂解物进行抗 Flag 免疫沉淀和抗 HA 免疫印迹分析。
（E） 在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下，用增加剂量的 TG 培养 1 h 的 HeLa 细胞提取物用 2 mM 次二酸二琥珀酸二琥珀酰亚胺酯 （DSS） 交联剂处理，并通过免疫印迹分析。
（F） 在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下，用 TG （1 μM） 培养指定时间点的 HeLa 细胞提取物用 2 mM 辛酸二琥珀酰亚胺酯 （DSS） 交联剂处理，并通过免疫印迹分析。
（G） 通过标记 UBAC2（绿色）对含或不含 Baf A1 （0.2 μM） 的 HeLa 细胞进行荧光显微镜分析。比例尺，20 μm。
（H） 对来自三个生物学独立实验的与 （G） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（I） 通过标记 UBAC2（绿色），在 Baf A 1 （0.2 μM） 存在下，对有或没有 TG （1 μM） 的 HeLa 细胞进行 1 小时的荧光显微镜分析。比例尺，20 μm。
（J） 对来自三个生物学独立实验的与 （I） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（K） 在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下，以 TG （1 μM） 处理转染编码 WT UBAC2 或其指定突变体的质粒的 293T 细胞 1 小时。用 2 mM 次二酸二琥珀酰亚胺酯 （DSS） 交联剂处理裂解物，并通过免疫印迹分析。
（L） 在存在 Baf A 1 （0.2 μM） 的情况下，通过标记 UBAC2（绿色）转染 WT UBAC2 载体及其指示突变体的 HeLa 细胞。比例尺，20 μm。（M） 对来自三个生物学独立实验的与 （L） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（N） 用编码 WT UBAC2 或其指定突变体的质粒转染稳定表达 ER 自噬报告基因的 HeLa 细胞，并用多西环素 （Dox） （200 ng/mL） 处理 24 小时。将细胞与 TG （1 μM） 孵育 8 小时后，收获裂解物并进行免疫印迹分析。
（O） 转染 Flag-UBAC2 或其指定突变体载体的 WT 和 UBAC2 KO HeLa 细胞的透射电子显微镜检查。ER 由黑色箭头指示。比例尺，200 nm。数据信息：对于 （B–G， I， K， L， N， O），显示了三个实验中的一个。在 （H， J， M） 中，数据表示为三个独立生物实验的平均 ± SEM。采用未配对的双尾 Student's t 检验分析差异的统计学意义，并显示 P 值。此图的源数据可在线获取。
见图五MARK2 催化 UBAC2 在 S223 位点的磷酸化。
图五
(A） 用抗 UBAC2 抗体对 HeLa 细胞制备的裂解物进行免疫沉淀。对沉淀的蛋白质进行质谱分析，鉴定出的激酶肽见表。该实验进行一次，每个条件重复两次。
（B） 对在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下用 TG （1 μM） 处理的 HeLa 细胞裂解物进行免疫沉淀和免疫印迹分析。
（C） Flag-MARK2 在 293T 细胞中表达，使用 Flag 亲和柱纯化，并用 Flag 肽洗脱。通过 SDS-PAGE 分析蛋白质纯度，并通过考马斯蓝染色 （CBS） 进行可视化。从 E 中纯化的 His-GFP-UBAC2。将大肠杆菌与Flag-MARK2在反应缓冲液中体外孵育，然后进行免疫沉淀并通过免疫印迹分析。
（D） 用加扰或 MARK2 特异性 siRNA 转染 HeLa 细胞，并在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下用 TG （1 μM） 处理 1 小时。对裂解物进行免疫沉淀和免疫印迹分析。
（E） 从 E 中纯化的 WT UBAC2 和 UBAC2 S223A 重组蛋白。通过在激酶缓冲液中通过 IP 将大肠杆菌与来自 293T 细胞的纯化 MARK2 一起孵育。通过放射自显影分析体外 UBAC2 S223 被 MARK2 磷酸化。
（F） 在 Baf A1 （0.2 μM） 存在或存在的情况下，用 TG （1 μM） 处理 WT 或 MARK2 KO THP-1 Mφs 1 小时。裂解物用 2 mM 二琥珀酰亚胺己酸酯 （DSS） 交联剂处理或使用磷酸丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸多克隆抗体免疫沉淀，并通过免疫印迹检测。
（G） 用 scramble 或 MARK2 特异性 siRNA 转染 293T 细胞，然后用 WT 或 S223A UBAC2 载体转染。在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下将细胞与 TG （1 μM） 孵育 1 小时后，用 2 mM 二叶酸二琥珀酰亚胺酯 （DSS） 交联剂处理裂解物，并通过免疫印迹分析。
（H） 用加扰或 MARK2 特异性 siRNA 以及 WT 载体或突变的 UBAC2 转染 HeLa 细胞。将细胞在 EBSS 中培养 3 小时，并通过荧光显微镜观察。比例尺，20 μm。
（I） 对来自三个生物学独立实验的与 （H） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（J） 用 MARK2 特异性或加扰 siRNA 转染 293T 细胞，然后用 Flag-GABARAP、HA 标记的 WT 或突变的 UBAC2 载体转染。用 Baf A1 （0.2 μM） 孵育细胞后，收获裂解物用于免疫沉淀和免疫印迹分析。
（K） 用 scramble 或 MARK2 特异性 siRNA 转染稳定表达 ER 自噬报告基因的 HeLa 细胞，然后用 Flag-UBAC2 载体转染。将细胞在 EBSS 中培养 3 小时，收获用于免疫印迹分析。
（L） 用表达 Flag 标记的 WT UBAC2 或其指示的点突变体的质粒转染 HeLa 细胞。将细胞在 EBSS 中培养 3 小时，并收获裂解物用于免疫印迹分析。数据信息：对于 （B–H， J–L），显示了三个实验中的一个。在 （I） 中，数据表示为三个独立生物实验的平均 ± SEM。采用未配对的双尾 Student's t 检验分析差异的统计学意义，并显示 P 值。此图的源数据可在线获取。
见图六
MARK2-UBAC2 轴通过 ER 自噬抑制 UPR 和炎症反应。
图六
(A） BDTM Tet-On 系统中的基因调控示意图。转录由反向四环素反应性转录激活剂 （rtTA） 开启，该激活剂与四环素反应元件 （TRE） 启动子结合，并在多西环素 （Dox） 存在下激活转录。
（B） 通过免疫印迹分析与指定浓度的 Dox 孵育 12 h 的 Flag 标记的 WT 或 LIRm UBAC2 诱导型 THP-1 细胞的裂解物。
（C） WT 或 LIRm UBAC2 诱导型 THP-1 细胞中 ER 应激诱导转录物的 qPCR 分析，与 Dox （200 ng/mL） 一起孵育过夜，并用 TM （5 μg/mL） 处理 6 小时。
（D） TM （5 μg/mL） 处理 6 小时的 WT 和 UBAC2 KO THP-1 细胞中 ER 应激诱导转录物的 qPCR 分析。） WT 或 LIRm UBAC2 诱导型 THP-1 细胞中炎症基因的 qPCR 分析与 Dox （200 ng/mL） 孵育过夜，并用 TM （5 μg/mL） 处理 12 小时。
（F） TM （5 μg/mL） 处理 12 小时的 WT 和 UBAC2 KO THP-1 细胞中炎性细胞因子的 ELISA 与 Dox （200 ng/mL） 一起孵育过夜并用 TM （5 μg/mL） 处理 24 小时。
（H） 用 TM （5 μg/mL） 处理 24 小时对 WT 和 UBAC2 KO THP-1 细胞中的炎性细胞因子进行 ELISA。
（I， J） 用 MARK2 特异性或加扰 siRNA 转染 FLAG-UBAC2 诱导型 THP-1 细胞，用或不用 Dox （200 ng/mL） 孵育过夜。与 TM （5 μg/mL） 孵育 12 h 后，通过 qPCR 分析 ER 应激诱导转录本 （I） 和炎症基因 （J） 的表达。数据信息：对于 （B），显示了三个实验中的一个。在 （C-J） 中，数据表示为三个独立生物实验的平均 ± SEM。采用未配对的双尾 Student's t 检验分析差异的统计学意义，并显示 P 值。此图的源数据可在线获取。
02
研究结论
综上所述，UBAC2 作为新发现的 ER 自噬受体发挥作用，该受体使用其保守的 LIR 基序与 GABARAP 特异性相互作用。在 ER 应激或饥饿诱导的自噬条件下，MARK2 催化 UBAC2 在 S223 位点的磷酸化，从而促进 UBAC2 的二聚化。通过 UBAC2 二聚化，UBAC2 驻留的 ER 可以被自噬体靶向和隔离以进行选择性降解。UBAC2 以 ER 自噬依赖性方式通过 UPR 抑制炎症反应（图 D）。EV5I）。我们的研究结果为剖析 UBAC2 在炎症性疾病中的致病机制提供了新的证据，并扩大了我们对基于 ER 自噬的治疗应用的理解。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
01
研究背景
内质网自噬是内质网 （ER） 片段自噬降解的一种选择性形式，在调节内质网稳态中起着重要作用。内质网自噬失调与未折叠蛋白反应 （UPR） 有关，这是诱发炎症性疾病的主要线索。然而，支撑 ER 自噬与疾病之间联系的分子机制仍然不清楚。在这里，我们确定了泛素相关结构域蛋白 2 （UBAC2） 是 ER 自噬的受体，同时是炎症反应的负调节因子。
UBAC2 在其细胞质结构域中包含一个经典的 LC3 相互作用区域 （LIR），该区域与自噬体 GABARAP 结合。在 ER 应激或自噬激活时，微管亲和调节激酶 2 （MARK2） 在丝氨酸 （S） 223 位点磷酸化 UBAC2，促进其二聚化。二聚化 UBAC2 与 GABARAP 的相互作用更强，从而促进 ER 的选择性降解。
此外，通过影响 ER 噬，UBAC2 抑制小鼠的炎症反应和急性溃疡性结肠炎 （UC）。我们的研究结果表明，由 MARK2-UBAC2 轴指导的 ER 自噬可能为炎症性疾病的治疗提供靶点。
见图一
UBAC2 可以通过自噬过程降解。
图一
(A） ERM-PhastID 屏幕示意图。
（B） 表达 ERM-PhastID 的 HeLa 细胞用或不用 thapsigargin （TG） （1 μM） 处理 2 h，并在生物素 （50 μM） 中培养 1 h。通过链霉亲和素包被的珠子收集生物素化蛋白，并使用质谱 （MS） 进行鉴定。该实验进行一次，每个条件重复两次。
（C） 表达 ERM-PhastID 的 HeLa 细胞中 UBAC2 的 mRNA 水平，用或不用 TG （1 μM） 处理 3 小时。
（D） 在不存在或存在 TG （1 μM） 的情况下培养 3 小时的 HeLa 细胞用 MG132 （10 μM）、卡非佐米 （10 μM） 或巴弗洛霉素 A1 （0.2 μM） 处理 6 小时。通过免疫印迹分析细胞提取物。
（E） 与（D） 相似样品中 UBAC2 蛋白丰度的定量，来自三个独立实验，一式两份。
（F） 在不存在或存在 Baf A1 （0.2 μM） 的情况下，用指定剂量的 TG 处理 HeLa 细胞 3 h，并收集蛋白质进行免疫印迹分析。
（G） 与 （F） 相似样品中 UBAC2 的 mRNA 水平。（H） HeLa 细胞在 EBSS 中培养指定时间点，有或没有 Baf A1 （0.2 μM） 处理，并通过免疫印迹检测裂解物。
（I） 对在 EBSS 中培养的指定时间点的野生型 （WT） 和 BECN1 KO 293 T 细胞的裂解物进行免疫印迹分析。
（J） 在不存在或存在 EBSS 的情况下，在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下培养 3 小时的 HeLa 细胞，然后用特异性抗体标记 UBAC2（绿色）和 WIPI2（红色）。比例尺，20 μm。
（K） 对来自三个生物学独立实验的与 （J） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（L） 在不存在或存在 EBSS 的情况下，在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下培养 3 小时的 HeLa 细胞，然后用特异性抗体标记 UBAC2（绿色）和 ATG16L1（红色）。比例尺，20 μm。
（M） 对来自三个生物学独立实验的与 （L） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（N） 在不存在或存在 EBSS 的情况下，在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下培养 3 小时的 HeLa 细胞，然后用特异性抗体标记 UBAC2（绿色）和 LAMP1（红色）。比例尺，20 μm。
（O） 对来自三个生物学独立实验的与 （N） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。数据信息：对于 （D， F， H–J， L， N），显示了三个实验中的一个。在 （C， E， G， K， M， O） 中，数据表示为三个独立生物实验的平均 ± SEM。采用未配对的双尾 Student's t 检验分析差异的统计学意义，并显示 P 值。此图的源数据可在线获取。
见图二UBAC2 通过其 LIR 与 GABARAP 交互。
图二
(A） 用编码 HA-UBAC2 和 Flag 标记的 ATG8 家族成员（Flag-LC3A、Flag-LC3B、Flag-LC3C、Flag-GABARAP、Flag-GABARAPL1 和 Flag-GABARAPL2）的质粒转染HEK293T细胞，然后用抗 Flag 珠进行免疫沉淀 （IP） 和用抗 HA 进行免疫印迹分析。整个过程是无免疫沉淀的全细胞裂解物 （WCL） 的免疫印迹分析。
（B、C）使用抗 GABARAP 进行免疫沉淀，并使用指定抗体对与 TG （1 μM） （B） 或 EBSS （C） 孵育不同时间的 HeLa 细胞提取物进行免疫沉淀。
（D） 在不存在或存在 EBSS 的情况下，在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下培养 3 小时的 HeLa 细胞，然后用特异性抗体标记 UBAC2（绿色）和 GABARAP（红色）。比例尺，20 μm。显示了三个实验中的一个代表性实验。
（E） 对来自三个生物学独立实验的与 （D） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（F） 人 UBAC2 的结构，描绘了已鉴定的 LC3 相互作用区域 （LIR）。
（G） 对转染编码 Flag-GABARAP 和野生型 （WT） HA-UBAC2 或其 LIR 突变体 （LIRm） 的载体的 293 个 T 细胞进行免疫沉淀和免疫印迹分析。
（H） 在 EBSS 存在下用 Flag-UBAC2 或其 LIRm 形式转染 HeLa 细胞 3 小时，同时存在 Baf A1 （0.2 μM），然后用特异性抗体标记 Flag（绿色）和 GABARAP（红色）。比例尺，20 μm。
（I） 对来自三个生物学独立实验的与 （H） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（J） 分别从大肠杆菌中表达和纯化 His-GFP-UBAC2 和 His-GABARAP。通过 SDS-PAGE 分析蛋白质纯度，并通过考马斯蓝染色 （CBS） 进行可视化。将 His-GFP-UBAC2 与 His-GABARAP 在体外反应缓冲液中孵育。用 GFP 珠子下拉后，通过免疫印迹分析结合的材料。
（K） 用编码 Flag-UBAC2 LIRm 的质粒转染 293T 细胞，然后在 EBSS 中培养指定时间点，有或没有 Baf A1 （0.2 μM）。免疫印迹法检测 UBAC2 蛋白表达水平。
（L） 在 EBSS 存在下用 GFP-UBAC2 或其 LIRm 形式转染 HeLa 细胞 3 小时，存在 Baf A1 （0.2 μM），然后用特异性抗体标记 LAMP1（红色）。比例尺，20 μm。（M） 与 （L） 相似样品的定量分析。
（N） 分别从大肠杆菌中表达和纯化 His-GFP-UBAC2 和 His-GABARAP 及其指示的突变体。GFP-UBAC2 与 His-GABARAP 在体外反应缓冲液中孵育。用 GFP 珠子下拉后，通过免疫印迹分析结合的材料。数据信息：对于 （A–D， G， H， J–L， N），显示了三个实验中的一个。在 （E， I， M） 中，数据表示为三个独立生物实验的平均 ± SEM。采用未配对的双尾 Student's t 检验分析差异的统计学意义，并显示 P 值。此图的源数据可在线获取。
见图三
UBAC2 是一种 ER 自噬受体。
图三
(A） ER 自噬报告基因 ss-RFP-GFP-KDEL 的示意图。ss-RFP-GFP-KDEL 被溶酶体酶裂解以产生 RFP 片段。GFP 信号在溶酶体中被淬灭。SS，信号序列。
（B） 稳定表达 ER 自噬报告基因的 WT 和 UBAC2 KO HeLa 细胞在多西环素 （Dox） （200 ng/mL） 存在下培养 24 小时以诱导报告基因。用 EBSS 培养指定时间点后，收获蛋白质用于免疫印迹分析。
（C） 量化 RFP 和 RFP-GFP 的谱带强度，并显示 RFP/RFP-GFP 的比率。
（D） 稳定表达 ER 自噬报告基因的 WT 或 UBAC2 KO HeLa 细胞用 Dox （200 ng/mL） 处理 24 小时。在 EBSS 中培养 3 小时后，处理细胞并通过荧光显微镜观察。比例尺，20 μm。
（E） 对来自三个生物学独立实验的与 （D） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（F） 通过免疫印迹分析在 EBSS 中培养的 WT 或 UBAC2 KO HeLa 细胞的裂解物。
（G） 用编码 WT 或 LIRm UBAC2 的质粒转染稳定表达 ER 自噬报告基因的 HeLa 细胞，并用 Dox （200 ng/mL） 处理 24 h。在 EBSS 中培养 3 小时后，通过荧光显微镜观察细胞。比例尺，20 μm。（H） 对来自三个生物学独立实验的与 （G） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（I） 用表达 WT UBAC2 或 UBAC2 LIRm 的质粒转染的 HeLa 细胞在正常培养基或 EBSS 中培养 3 小时。收获裂解物用于免疫印迹分析。
（J） 转染 Flag-UBAC2 载体或其 LIRm 并用 EBSS 处理 3 小时的 WT 和 UBAC2 KO HeLa 细胞的透射电子显微镜检查。ER 由黑色箭头指示。比例尺，200 nm。
（K） 在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下与 EBSS 一起孵育 3 h 的 HeLa 细胞提取物，用抗 UBAC2 进行免疫沉淀，并使用指定抗体进行免疫印迹分析。
（L） 稳定表达 ER 自噬报告基因的 HeLa 细胞，用在 Dox （200 ng/mL） 存在下培养的加扰、FAM134B 或 UBAC2 特异性 siRNA 转染 24 小时以诱导报告基因。用 EBSS 处理 3 小时后。收集裂解物用于免疫印迹分析。数据信息：对于 （B， D， F， G， I–L），显示了三个实验中的一个。在 （C， E， H） 中，数据表示为三个独立生物实验的平均 ± SEM。采用未配对的双尾 Student's t 检验分析差异的统计学意义，并显示 P 值。此图的源数据可在线获取。
见图四
S223 位点的 UBAC2 磷酸化对其在 ER 自噬中的作用至关重要。
图四
(A） 质谱分析确定了 UBAC2 上丝氨酸 223 位点的磷酸化位点。
（B） 使用磷酸丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸多克隆抗体对指定时间点用 TG （1 μM） 处理的 HeLa 细胞提取物进行免疫沉淀，并用 UBAC2 抗体进行免疫印迹。
（C） 在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下，用 TG （1 μM） 处理转染 Flag-UBAC2 载体或其 S223A 突变体的 293T 细胞 1 小时。对裂解物进行免疫共沉淀和免疫印迹分析。
（D） 对转染 Flag-UBAC2 和 HA-UBAC2 质粒的 293T 细胞裂解物进行抗 Flag 免疫沉淀和抗 HA 免疫印迹分析。
（E） 在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下，用增加剂量的 TG 培养 1 h 的 HeLa 细胞提取物用 2 mM 次二酸二琥珀酸二琥珀酰亚胺酯 （DSS） 交联剂处理，并通过免疫印迹分析。
（F） 在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下，用 TG （1 μM） 培养指定时间点的 HeLa 细胞提取物用 2 mM 辛酸二琥珀酰亚胺酯 （DSS） 交联剂处理，并通过免疫印迹分析。
（G） 通过标记 UBAC2（绿色）对含或不含 Baf A1 （0.2 μM） 的 HeLa 细胞进行荧光显微镜分析。比例尺，20 μm。
（H） 对来自三个生物学独立实验的与 （G） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（I） 通过标记 UBAC2（绿色），在 Baf A 1 （0.2 μM） 存在下，对有或没有 TG （1 μM） 的 HeLa 细胞进行 1 小时的荧光显微镜分析。比例尺，20 μm。
（J） 对来自三个生物学独立实验的与 （I） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（K） 在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下，以 TG （1 μM） 处理转染编码 WT UBAC2 或其指定突变体的质粒的 293T 细胞 1 小时。用 2 mM 次二酸二琥珀酰亚胺酯 （DSS） 交联剂处理裂解物，并通过免疫印迹分析。
（L） 在存在 Baf A 1 （0.2 μM） 的情况下，通过标记 UBAC2（绿色）转染 WT UBAC2 载体及其指示突变体的 HeLa 细胞。比例尺，20 μm。（M） 对来自三个生物学独立实验的与 （L） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（N） 用编码 WT UBAC2 或其指定突变体的质粒转染稳定表达 ER 自噬报告基因的 HeLa 细胞，并用多西环素 （Dox） （200 ng/mL） 处理 24 小时。将细胞与 TG （1 μM） 孵育 8 小时后，收获裂解物并进行免疫印迹分析。
（O） 转染 Flag-UBAC2 或其指定突变体载体的 WT 和 UBAC2 KO HeLa 细胞的透射电子显微镜检查。ER 由黑色箭头指示。比例尺，200 nm。数据信息：对于 （B–G， I， K， L， N， O），显示了三个实验中的一个。在 （H， J， M） 中，数据表示为三个独立生物实验的平均 ± SEM。采用未配对的双尾 Student's t 检验分析差异的统计学意义，并显示 P 值。此图的源数据可在线获取。
见图五MARK2 催化 UBAC2 在 S223 位点的磷酸化。
图五
(A） 用抗 UBAC2 抗体对 HeLa 细胞制备的裂解物进行免疫沉淀。对沉淀的蛋白质进行质谱分析，鉴定出的激酶肽见表。该实验进行一次，每个条件重复两次。
（B） 对在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下用 TG （1 μM） 处理的 HeLa 细胞裂解物进行免疫沉淀和免疫印迹分析。
（C） Flag-MARK2 在 293T 细胞中表达，使用 Flag 亲和柱纯化，并用 Flag 肽洗脱。通过 SDS-PAGE 分析蛋白质纯度，并通过考马斯蓝染色 （CBS） 进行可视化。从 E 中纯化的 His-GFP-UBAC2。将大肠杆菌与Flag-MARK2在反应缓冲液中体外孵育，然后进行免疫沉淀并通过免疫印迹分析。
（D） 用加扰或 MARK2 特异性 siRNA 转染 HeLa 细胞，并在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下用 TG （1 μM） 处理 1 小时。对裂解物进行免疫沉淀和免疫印迹分析。
（E） 从 E 中纯化的 WT UBAC2 和 UBAC2 S223A 重组蛋白。通过在激酶缓冲液中通过 IP 将大肠杆菌与来自 293T 细胞的纯化 MARK2 一起孵育。通过放射自显影分析体外 UBAC2 S223 被 MARK2 磷酸化。
（F） 在 Baf A1 （0.2 μM） 存在或存在的情况下，用 TG （1 μM） 处理 WT 或 MARK2 KO THP-1 Mφs 1 小时。裂解物用 2 mM 二琥珀酰亚胺己酸酯 （DSS） 交联剂处理或使用磷酸丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸多克隆抗体免疫沉淀，并通过免疫印迹检测。
（G） 用 scramble 或 MARK2 特异性 siRNA 转染 293T 细胞，然后用 WT 或 S223A UBAC2 载体转染。在 Baf A1 （0.2 μM） 存在下将细胞与 TG （1 μM） 孵育 1 小时后，用 2 mM 二叶酸二琥珀酰亚胺酯 （DSS） 交联剂处理裂解物，并通过免疫印迹分析。
（H） 用加扰或 MARK2 特异性 siRNA 以及 WT 载体或突变的 UBAC2 转染 HeLa 细胞。将细胞在 EBSS 中培养 3 小时，并通过荧光显微镜观察。比例尺，20 μm。
（I） 对来自三个生物学独立实验的与 （H） 相似的样品进行定量分析（每个实验每个条件对 20 个细胞进行评分）。
（J） 用 MARK2 特异性或加扰 siRNA 转染 293T 细胞，然后用 Flag-GABARAP、HA 标记的 WT 或突变的 UBAC2 载体转染。用 Baf A1 （0.2 μM） 孵育细胞后，收获裂解物用于免疫沉淀和免疫印迹分析。
（K） 用 scramble 或 MARK2 特异性 siRNA 转染稳定表达 ER 自噬报告基因的 HeLa 细胞，然后用 Flag-UBAC2 载体转染。将细胞在 EBSS 中培养 3 小时，收获用于免疫印迹分析。
（L） 用表达 Flag 标记的 WT UBAC2 或其指示的点突变体的质粒转染 HeLa 细胞。将细胞在 EBSS 中培养 3 小时，并收获裂解物用于免疫印迹分析。数据信息：对于 （B–H， J–L），显示了三个实验中的一个。在 （I） 中，数据表示为三个独立生物实验的平均 ± SEM。采用未配对的双尾 Student's t 检验分析差异的统计学意义，并显示 P 值。此图的源数据可在线获取。
见图六
MARK2-UBAC2 轴通过 ER 自噬抑制 UPR 和炎症反应。
图六
(A） BDTM Tet-On 系统中的基因调控示意图。转录由反向四环素反应性转录激活剂 （rtTA） 开启，该激活剂与四环素反应元件 （TRE） 启动子结合，并在多西环素 （Dox） 存在下激活转录。
（B） 通过免疫印迹分析与指定浓度的 Dox 孵育 12 h 的 Flag 标记的 WT 或 LIRm UBAC2 诱导型 THP-1 细胞的裂解物。
（C） WT 或 LIRm UBAC2 诱导型 THP-1 细胞中 ER 应激诱导转录物的 qPCR 分析，与 Dox （200 ng/mL） 一起孵育过夜，并用 TM （5 μg/mL） 处理 6 小时。
（D） TM （5 μg/mL） 处理 6 小时的 WT 和 UBAC2 KO THP-1 细胞中 ER 应激诱导转录物的 qPCR 分析。） WT 或 LIRm UBAC2 诱导型 THP-1 细胞中炎症基因的 qPCR 分析与 Dox （200 ng/mL） 孵育过夜，并用 TM （5 μg/mL） 处理 12 小时。
（F） TM （5 μg/mL） 处理 12 小时的 WT 和 UBAC2 KO THP-1 细胞中炎性细胞因子的 ELISA 与 Dox （200 ng/mL） 一起孵育过夜并用 TM （5 μg/mL） 处理 24 小时。
（H） 用 TM （5 μg/mL） 处理 24 小时对 WT 和 UBAC2 KO THP-1 细胞中的炎性细胞因子进行 ELISA。
（I， J） 用 MARK2 特异性或加扰 siRNA 转染 FLAG-UBAC2 诱导型 THP-1 细胞，用或不用 Dox （200 ng/mL） 孵育过夜。与 TM （5 μg/mL） 孵育 12 h 后，通过 qPCR 分析 ER 应激诱导转录本 （I） 和炎症基因 （J） 的表达。数据信息：对于 （B），显示了三个实验中的一个。在 （C-J） 中，数据表示为三个独立生物实验的平均 ± SEM。采用未配对的双尾 Student's t 检验分析差异的统计学意义，并显示 P 值。此图的源数据可在线获取。
02
研究结论
综上所述，UBAC2 作为新发现的 ER 自噬受体发挥作用，该受体使用其保守的 LIR 基序与 GABARAP 特异性相互作用。在 ER 应激或饥饿诱导的自噬条件下，MARK2 催化 UBAC2 在 S223 位点的磷酸化，从而促进 UBAC2 的二聚化。通过 UBAC2 二聚化，UBAC2 驻留的 ER 可以被自噬体靶向和隔离以进行选择性降解。UBAC2 以 ER 自噬依赖性方式通过 UPR 抑制炎症反应（图 D）。EV5I）。我们的研究结果为剖析 UBAC2 在炎症性疾病中的致病机制提供了新的证据，并扩大了我们对基于 ER 自噬的治疗应用的理解。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
