在进行Western Blot（WB）实验时，SDS-PAGE凝胶的制备是至关重要的一步，它直接影响到后续实验结果的清晰度和准确性。以下是一些关于SDS-PAGE凝胶制备的技巧及常见问题的解决方法：
SDS-PAGE凝胶制备步骤
1. 玻璃板梳子的清洁
• 步骤：先用自来水浸泡玻璃板5分钟，然后用洗洁精清洗。注意厚玻璃板两侧沟槽容易残留胶，可以用尖锐的东西轻刮。之后用自来水冲洗干净泡沫，再用纯水冲洗。最后，可以选择37度烘干或者使用吹风筒吹干，但注意避免用热风长时间近距离吹，以防厚玻璃板两侧的粘胶融化。
2. 制胶试剂准备
• 所需试剂：超纯水、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8 Tris-HCl、10% SDS、10%过硫酸铵（APS）、TEMED、95%酒精（压胶用）。
• 注意事项：检查试剂的有效期，确保试剂澄清透明，无沉淀或晶体析出。特别是30%丙烯酰胺应避光4度保存，pH8.8 Tris-HCl和pH6.8 Tris-HCl易出现沉淀，且有两个浓度（1.0M和1.5M）可选，需根据配方表购买。10% SDS在低温下易结晶析出，APS化学性质活泼，常温下易变质失效，建议配好后分装冻于-20度冰箱。TEMED具有神经毒性，使用时需在通风环境下操作，并密闭避光保存于4度。
3. 制备分离胶
• 步骤：按照配方表依次加入试剂，加完SDS后加APS前可先混匀，然后迅速加入APS和TEMED并马上混匀（手摇或振荡器摇匀）。灌胶时注意胶的高度，要留有足够的空间给压缩胶。之后用95%酒精压胶，缓缓注入并边加边移动枪嘴以防冲出凹陷。室温静置约25分钟待其凝固。
4. 制备压缩胶及插梳子
• 步骤：判断下层胶是否凝固后，倒掉酒精并用吸水纸吸干残余酒精（注意不要戳到胶面）。然后混匀上层胶试剂并迅速灌胶，直接倒但注意别倒多。之后迅速插梳子，一次性操作不可拔出再插。室温静置约20分钟待其凝固。
5. 凝胶的暂存
• 步骤：根据剩余在离心管中的上层胶是否凝固来判断玻璃板中的上层胶是否凝固。确认无误后小心取下玻璃板，用保鲜膜包裹好每块玻璃板，然后浸泡于纯水中置于4度冰箱保存。一般不建议放置超过一周。
常见问题及解决方法
1. 漏胶
• 可能原因：玻璃板没对齐、玻璃板底部缺损、厚玻璃板边条密闭性不良、塑料夹子太松等。
• 解决方法：确保玻璃板干燥并对齐，使用正确的对齐和夹紧技巧。检查玻璃板底部和边条是否完好，必要时更换或修复。
2. 胶不凝
• 可能原因：APS失效、TEMED失效、胶在未完全凝固时被移动等。
• 解决方法：确认试剂的有效性和配比是否正确，并确保混合均匀。如果配比正确但胶仍未凝固，可以考虑增加凝固剂的用量或延长凝固时间。
3. 胶凝得不均匀
• 可能原因：玻璃板没洗干净、试剂有沉淀、没混匀、加酒精冲得太快、酒精没干透等。
• 解决方法：彻底清洗玻璃板并确保试剂无沉淀、混合均匀。加酒精时要缓缓注入并边加边移动枪嘴以防冲出凹陷。等待酒精完全干燥后再进行下一步操作。
4. 胶中有气泡
• 可能原因：胶垫材质问题、梳子插入不当等。
• 解决方法：改用实心的软胶垫或加一层保鲜膜以防止气泡产生。梳子插入时要先插一侧再插另一侧以减少气泡产生。
5. 上层胶边缘有缺损
• 可能原因：厚玻璃板边条密闭性不良、长期使用粘胶被腐蚀等。
• 解决方法：检查并更换边条或粘胶以确保密闭性良好。避免长期使用同一套玻璃板以减少粘胶腐蚀的可能性。
6. 拔梳子后泳道有胶丝
• 可能原因：TEMED用量过多导致胶凝固过快。
• 解决方法：减少TEMED的用量以避免胶凝固过快。
7. 拔梳子后泳道歪斜
• 可能原因：梳子与玻璃板不匹配。
• 解决方法：在灌胶前先测试梳子是否与玻璃板匹配，选择合适的梳子进行使用。
通过以上技巧和解决方法，可以帮助实验者更好地制备SDS-PAGE凝胶，从而提高Western Blot实验的成功率和准确性。
SDS-PAGE凝胶制备步骤
1. 玻璃板梳子的清洁
• 步骤：先用自来水浸泡玻璃板5分钟，然后用洗洁精清洗。注意厚玻璃板两侧沟槽容易残留胶，可以用尖锐的东西轻刮。之后用自来水冲洗干净泡沫，再用纯水冲洗。最后，可以选择37度烘干或者使用吹风筒吹干，但注意避免用热风长时间近距离吹，以防厚玻璃板两侧的粘胶融化。
2. 制胶试剂准备
• 所需试剂：超纯水、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8 Tris-HCl、10% SDS、10%过硫酸铵（APS）、TEMED、95%酒精（压胶用）。
• 注意事项：检查试剂的有效期，确保试剂澄清透明，无沉淀或晶体析出。特别是30%丙烯酰胺应避光4度保存，pH8.8 Tris-HCl和pH6.8 Tris-HCl易出现沉淀，且有两个浓度（1.0M和1.5M）可选，需根据配方表购买。10% SDS在低温下易结晶析出，APS化学性质活泼，常温下易变质失效，建议配好后分装冻于-20度冰箱。TEMED具有神经毒性，使用时需在通风环境下操作，并密闭避光保存于4度。
3. 制备分离胶
• 步骤：按照配方表依次加入试剂，加完SDS后加APS前可先混匀，然后迅速加入APS和TEMED并马上混匀（手摇或振荡器摇匀）。灌胶时注意胶的高度，要留有足够的空间给压缩胶。之后用95%酒精压胶，缓缓注入并边加边移动枪嘴以防冲出凹陷。室温静置约25分钟待其凝固。
4. 制备压缩胶及插梳子
• 步骤：判断下层胶是否凝固后，倒掉酒精并用吸水纸吸干残余酒精（注意不要戳到胶面）。然后混匀上层胶试剂并迅速灌胶，直接倒但注意别倒多。之后迅速插梳子，一次性操作不可拔出再插。室温静置约20分钟待其凝固。
5. 凝胶的暂存
• 步骤：根据剩余在离心管中的上层胶是否凝固来判断玻璃板中的上层胶是否凝固。确认无误后小心取下玻璃板，用保鲜膜包裹好每块玻璃板，然后浸泡于纯水中置于4度冰箱保存。一般不建议放置超过一周。
常见问题及解决方法
1. 漏胶
• 可能原因：玻璃板没对齐、玻璃板底部缺损、厚玻璃板边条密闭性不良、塑料夹子太松等。
• 解决方法：确保玻璃板干燥并对齐，使用正确的对齐和夹紧技巧。检查玻璃板底部和边条是否完好，必要时更换或修复。
2. 胶不凝
• 可能原因：APS失效、TEMED失效、胶在未完全凝固时被移动等。
• 解决方法：确认试剂的有效性和配比是否正确，并确保混合均匀。如果配比正确但胶仍未凝固，可以考虑增加凝固剂的用量或延长凝固时间。
3. 胶凝得不均匀
• 可能原因：玻璃板没洗干净、试剂有沉淀、没混匀、加酒精冲得太快、酒精没干透等。
• 解决方法：彻底清洗玻璃板并确保试剂无沉淀、混合均匀。加酒精时要缓缓注入并边加边移动枪嘴以防冲出凹陷。等待酒精完全干燥后再进行下一步操作。
4. 胶中有气泡
• 可能原因：胶垫材质问题、梳子插入不当等。
• 解决方法：改用实心的软胶垫或加一层保鲜膜以防止气泡产生。梳子插入时要先插一侧再插另一侧以减少气泡产生。
5. 上层胶边缘有缺损
• 可能原因：厚玻璃板边条密闭性不良、长期使用粘胶被腐蚀等。
• 解决方法：检查并更换边条或粘胶以确保密闭性良好。避免长期使用同一套玻璃板以减少粘胶腐蚀的可能性。
6. 拔梳子后泳道有胶丝
• 可能原因：TEMED用量过多导致胶凝固过快。
• 解决方法：减少TEMED的用量以避免胶凝固过快。
7. 拔梳子后泳道歪斜
• 可能原因：梳子与玻璃板不匹配。
• 解决方法：在灌胶前先测试梳子是否与玻璃板匹配，选择合适的梳子进行使用。
通过以上技巧和解决方法，可以帮助实验者更好地制备SDS-PAGE凝胶，从而提高Western Blot实验的成功率和准确性。
