一、慢病毒包装及浓缩
1.实验准备
①准备实验所需材料，包括健康的HEK 293T细胞、转染试剂（如PEI、lipo3000等）、无血清培养基、DMEM完全培养基（含10% FBS和1% P/S）。
②准备无菌注射器和0.45μm的滤器
③准备质粒:包装质粒（pSPAX2）、包膜质粒（pMD2.G）、转移质粒（目的基因）。
2.细胞铺板：在实验的第一天，将293T细胞分散于培养皿中，控制细胞数量在每个直径为10厘米的培养皿内约300-500万个细胞。
3.三质粒转染
①在第二天进行转染操作，细胞的适宜密度为70-80%。在三质粒转染过程中，需要合理调配pSPAX2、PMD2.G和目的基因质粒的比例。常用的比例为pSPAX2:PMD2.G:目的基因质粒为3:1:4或3:2:4，数量单位为微克。
②转染所需总质量约为18-20微克，PEI的添加量是质粒质量的2.5-3倍。
③以PEI为例，转染操作步骤如下：将质粒与500μl无血清培养基混合（液体A）、将PEI与500μl无血清培养基混合（液体B），逐滴将液体B缓慢滴入液体A中，静置于室温15-20分钟后，再缓慢滴入细胞培养皿中。
4.观察
实验第三天，通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达状态。此时可选择换液或不换液，但通常选择不换液以保持系统稳定。
5.收集病毒液
① 转染后48小时，收集病毒上清液至15/50 mL离心管中，4℃保存；72小时再次收集，汇总后进行4℃、3000 rpm离心10分钟以去除细胞碎片。
② 使用注射器吸取上清，或直接将液体倒入注射器内，经过0.45 μm黄色滤膜过滤至洁净的15/50 mL离心管中。
6.病毒液浓缩
① 制备浓缩液：将80 g PEG-8000和14 g NaCl溶于80 mL ddH2O，加入120 mL 1x PBS，振荡混匀至溶解。使用NaOH调pH至7.0-7.2，高压灭菌或0.2 μm滤器过滤，4℃保存。可选用市售浓缩试剂以简化流程。
② 混合1/3体积的浓缩液与病毒液，4℃摇床混合12小时。
③ 4℃、4500 rpm离心30分钟，弃去上清以获得病毒颗粒。以1/10至1/100原病毒液体积的培养基重悬沉淀，100 μl分装入1.5 ml EP管中，于-80℃保存。
二、注意事项
① 细胞状态：293T细胞的健康状况至关重要，细胞体积越大，转染效率通常越高。确保每次进行病毒包装的细胞代次不超过第10代，避免细菌、真菌和支原体的污染。同时，建议避免使用国产血清。复苏后的细胞需传代2次后方可用于病毒包装，并在传代后18-24小时内保持细胞密度约80%。
② 质粒质量：用于包装的质粒必须经过彻底去除内毒素的制备，建议质量浓度不低于1 μg/μl，且A260/280比值应在1.7-1.8之间以确保纯度。
③ 操作环境：所有涉及病毒的操作应在生物安全柜中进行，以防止气溶胶形成和病毒扩散。
④ 病毒保存：需注意每次冻融过程会导致病毒滴度下降2-4倍；通常情况下，病毒液可在-80℃条件下保存长达一年。
⑤ 安全措施：操作过程中需佩戴一次性口罩和手套，防止病毒接触口腔、眼睛、鼻部、耳朵或其他开放性伤口。实验结束后，应立即清理并高压消毒所有接触过病毒的器具。
⑥ 避免污染：实验进行时需特别注意避免病毒污染。一旦发生污染，应立即使用84消毒液彻底擦拭。完成实验后的垃圾应浸泡于84消毒液中24小时后再丢弃。