如何挑选WB封闭液？
在目标蛋白检测之前，WB封闭的步骤旨在封锁膜上未结合的区域，以避免抗体的非目标性结合。
封闭剂内含非目标性蛋白或其他分子，它们能与膜表面的非特异性位点结合，从而减少抗体与膜的非目标性结合，并减弱背景噪声。此外，封闭还能增强膜的稳定性，防止在抗体孵育过程中膜变干或受损。
封闭液中的蛋白质能够结合到膜上的空白区域，通过物理性填补（堆积）和吸附覆盖的方式牢固地附着在膜上。这种“填补”和“遮盖”作用能有效避免一抗的非特异性结合（即封闭作用）。
这两种机制使得封闭液中的蛋白质能够紧密地结合在空白位点上，从而确保抗体蛋白不会被非特异性地吸附到膜上，而只会与特异性蛋白结合。
WB封闭液的种类有哪些？
1. 脱脂乳粉
其最大优势在于价格低廉，因此常作为首选。然而，由于其成分相对复杂，其适用范围相对较窄。
• 乳粉中的蛋白质种类多样，由于WB膜表面的微观结构并不均匀，因此含有多种分子量蛋白质的乳粉能提供更全面的封闭效果。
• 脱脂乳粉中可能残留少量的生物素和碱性磷酸酶，在使用生物素-亲和素系统及碱性磷酸酶标记的二抗时，可能会导致高背景或基线水平升高。
• 磷酸化抗体可能会使背景增加，并且由于乳粉本身含有生物素，因此不能用于生物素标记的抗体系统。
• 乳粉成分复杂，且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒制备中较少使用。
2. 牛血清白蛋白（BSA）
牛血清白蛋白是从牛血清中提纯得到的一种球蛋白，是除脱脂乳粉外非常常用的封闭剂。
• 通常，含有BSA的封闭液浓度为2-5%（重量/体积）。由于其价格较高，研究人员通常会选择尽可能低但有效的浓度。
• 若免疫原是偶联BSA的，由于BSA具有强烈的免疫原性，可能会产生大量针对BSA的抗体。为避免交叉反应，此时不宜使用BSA或脱脂乳粉进行封闭，而应选择酪蛋白或无蛋白封闭剂。
• 尽管BSA不是磷蛋白且为单一蛋白，但在提纯过程中可能含有IgG或其他血清蛋白等污染物，这些蛋白可能与哺乳动物抗体产生交叉反应，导致高背景、杂带增多或基线水平升高。
3. 血清
血清也是从哺乳动物体内提取的，富含蛋白质。例如胎牛血清（FBS），它含有大量蛋白质，可用于封闭。
• 血清作为封闭剂的原理主要有两点：首先，待检样本中可能存在与蛋白非特异性结合的物质，导致背景过高。因此，可以使用BSA或血清来封闭这些非特异性结合位点。在这方面，BSA和血清没有明显区别。其次，待检样本中可能存在Fc受体，它们可以与抗体的恒定区结合，这种结合与抗体的特异性无关。由于血清中含有抗体，因此可以用血清来封闭一抗和二 un与样本Fc受体之间的结合。而BSA无法封闭Fc受体。
• 血清价格更昂贵，且所需浓度更高（5-10% 重量/体积）。因此，在WB实验中血清使用较少，更多应用于免疫组化和免疫荧光实验中的样本封闭。
4. 酪蛋白
酪蛋白的作用与BSA相似，但普通酪蛋白不易溶解。在中性和碱性条件下带负电，与同样带负电的胶体金之间存在排斥力。而膜通常带正电，因此与酪蛋白有一定的吸附作用，使用酪蛋白封闭效果较好。
5. 鱼皮明胶
明胶是胶原蛋白的产物，从冷水鱼皮肤中提取的明胶即使在低温下也不会凝固。通常使用浓度为0.1-5%（重量/体积）。与BSA和血清不同，它不含任何血清蛋白，因此不会与哺乳动物抗体产生交叉反应，大大降低了非特异性背景信号。但鱼胶含有内源性生物素，因此不适用于生物素标记的抗体系统。
6. 无蛋白化合物
• 甲醛：与PVDF膜表面的微观结构反应或结合，改变其结合蛋白的疏水性质或空间结构。
• 去污剂（吐温-20）：具有抗原修复作用，通过与膜的疏水性吸附，对非特异性吸附具有强烈的洗脱作用。同时，它还能降低蛋白间的疏水作用，提高特异性抗体的识别能力。
• 此外，明胶、聚乙二醇（PEG）等也可作为封闭剂使用。