一、细胞
1.细胞接种浓度的选择
• 贴壁细胞：鉴于细胞尺寸的差异，建议依据实际情况适当调整细胞密度分布。
• 悬浮细胞：通常在96孔板中，每孔置入10000个细胞，可通过细胞计数方式进行布板。
采用状态优良的细胞进行铺板，传代过多的细胞不宜使用。铺板过稀，细胞杀伤效果不明显；铺板过密，细胞可能大量死亡。细胞密度多采用10000个/孔，100ul/孔。
2.药物浓度与处理时长的设定
• 不同细胞对药物的敏感性不同。若药物浓度未知，可查阅相关文献，参考他人研究成果初步确定一个较大范围，计算药物的半数抑制浓度（IC50），并依据IC50值设定药物使用浓度。
3.培养时长
• 若需培养超过48小时，则需更换培养液。（48小时换液）
4.无菌操作要求
• 进行MTT或CCK8实验时，务必进行无菌操作，因为污染会严重影响吸光值的准确性。细菌污染会导致比色反应的光密度值升高，干扰实验结果。
5.对照设置
• 实验过程中需设置调零孔、对照孔和加药孔。调零孔中加入培养基、MTT或CCK-8及DMSO；对照孔和加药孔均需加入细胞、培养液和MTT或CCK-8。对照孔中加入溶解药物的介质（通常为DMSO），加药组则需添加不同浓度的药物。
6.副孔设置
• 每个处理组至少设置3个副孔，3-5个均可。
二、实验操作步骤
（1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为1万至2万个细胞/毫升，取100微升加入96孔板中。同时，96孔板边缘孔需用无菌PBS或适宜培养基填充。每孔准备3-5个副孔。
（2）悬浮细胞铺板后置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养1小时，然后加药。药物建议现配现用，采用半比稀释法，用培养基配药。（长期保存的药物按说明书规定的溶液配制，如DMSO；一次性使用的药物用培养基稀释至最终浓度。）
（3）置于37℃、5%CO2环境中孵育至药物处理时间。
（4）每孔加入10μL MTT溶液（5mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4小时。也可考虑使用CCK-8替代MTT，更为便捷。
（5）4小时后，每孔加入100ul MTT缓冲液，反应至指定时间，确保结晶物充分溶解。随后，使用酶联免疫检测仪在OD 570nm（经630nm校准）下测量各孔吸光值。
三、MTT的配制方法
通常建议现配现用MTT，过滤后在4℃避光保存。配制好的MTT需保持无菌，因为MTT对细菌极为敏感。添加至96孔板时可不避光，或关闭操作台照明灯。配制MTT时，建议使用PBS溶解，并在60℃水浴中辅以超声处理促进溶解。
四、MTT的添加
MTT添加量宜多不宜少，10µl即可。若某些孔加入MTT后立即呈蓝黑色，可能已受污染。加入MTT前，建议先在显微镜下观察，检查孔内细胞是否受细菌污染。
CCK8使用指南
1、将100ul细胞悬液接种至96孔板中，置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养。
2、每孔添加10ul CCK-8试剂。
3、将培养板放入培养箱中培养1-4小时。
4、在450nm波长下测定吸光度，参考波长设为600nm以上。
OD值的测量
细胞密度高时，测得的吸光度也偏高；细胞密度低时，吸光度偏低。此外，吸光度值与细胞状态相关，细胞状态不佳时吸光度值通常较低。细胞数量少或培养时间短时，OD值也偏低。若各孔差异明显，可能存在污染现象；如空白孔OD值异常高，很可能是受细菌污染影响。
为确保实验准确性，通常为每个浓度设置5-6个重复孔。在最终统计数据时，可排除一个最高值和一个最低值，或剔除可能出现的异常数值。这些异常数值可能与多种因素有关，如细胞污染、细胞死亡、培养液蒸发、MTT液的准确使用，以及37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育时间是否恰当（通常为1-4小时）。这些因素密切相关。
五、实验注意事项
1.建议控制细胞接种密度，尤其是悬浮细胞。每孔10000个左右的细胞数量较为合适，不宜过多。对于肿瘤细胞，更需避免过高的接种密度，宁少勿多，以确保实验结果的准确性和可靠性。
2.MTT和CCK-8实验本身属于相对粗略的实验方法，因此结果中出现小幅波动或误差属正常现象。
3.铺板时，务必确保细胞悬液充分混合。若长时间静置，需用枪头重复吹打几次以混合均匀。细胞分布不均匀会导致每孔细胞数量不一致，建议每接几个孔就进行混匀操作。移液枪操作需熟练，尽量避免误差。同时，吹散次数过多也会影响细胞活力，因此请尽快完成铺板操作。
4.进行吹打操作时，需注意细胞悬液总量不宜过多。过多悬液易造成污染，且细胞团不易被吹散。建议将细胞悬液控制在6-7ml左右。若悬液量过少，易产生大量气泡，影响实验进行。
5.吸液时，应将吸头置于悬浮液底部稍提起；吹液入管时，要保持接近液面，以避免产生气泡。
6.每块板加完后，记得晃动培养板，使细胞分散均匀。铺好板后静置2分钟，观察细胞分布均匀度及每孔细胞量是否大致一致。
7.避免边缘效应：在96孔板中，四周一圈的孔通常仅用作空白对照，不应培养细胞，否则这四排数据可能偏高或偏低。在最外侧一圈的孔中，务必添加水、PBS或培养液，以有效防止蒸发。
1.细胞接种浓度的选择
• 贴壁细胞：鉴于细胞尺寸的差异，建议依据实际情况适当调整细胞密度分布。
• 悬浮细胞：通常在96孔板中，每孔置入10000个细胞，可通过细胞计数方式进行布板。
采用状态优良的细胞进行铺板，传代过多的细胞不宜使用。铺板过稀，细胞杀伤效果不明显；铺板过密，细胞可能大量死亡。细胞密度多采用10000个/孔，100ul/孔。
2.药物浓度与处理时长的设定
• 不同细胞对药物的敏感性不同。若药物浓度未知，可查阅相关文献，参考他人研究成果初步确定一个较大范围，计算药物的半数抑制浓度（IC50），并依据IC50值设定药物使用浓度。
3.培养时长
• 若需培养超过48小时，则需更换培养液。（48小时换液）
4.无菌操作要求
• 进行MTT或CCK8实验时，务必进行无菌操作，因为污染会严重影响吸光值的准确性。细菌污染会导致比色反应的光密度值升高，干扰实验结果。
5.对照设置
• 实验过程中需设置调零孔、对照孔和加药孔。调零孔中加入培养基、MTT或CCK-8及DMSO；对照孔和加药孔均需加入细胞、培养液和MTT或CCK-8。对照孔中加入溶解药物的介质（通常为DMSO），加药组则需添加不同浓度的药物。
6.副孔设置
• 每个处理组至少设置3个副孔，3-5个均可。
二、实验操作步骤
（1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为1万至2万个细胞/毫升，取100微升加入96孔板中。同时，96孔板边缘孔需用无菌PBS或适宜培养基填充。每孔准备3-5个副孔。
（2）悬浮细胞铺板后置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养1小时，然后加药。药物建议现配现用，采用半比稀释法，用培养基配药。（长期保存的药物按说明书规定的溶液配制，如DMSO；一次性使用的药物用培养基稀释至最终浓度。）
（3）置于37℃、5%CO2环境中孵育至药物处理时间。
（4）每孔加入10μL MTT溶液（5mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4小时。也可考虑使用CCK-8替代MTT，更为便捷。
（5）4小时后，每孔加入100ul MTT缓冲液，反应至指定时间，确保结晶物充分溶解。随后，使用酶联免疫检测仪在OD 570nm（经630nm校准）下测量各孔吸光值。
三、MTT的配制方法
通常建议现配现用MTT，过滤后在4℃避光保存。配制好的MTT需保持无菌，因为MTT对细菌极为敏感。添加至96孔板时可不避光，或关闭操作台照明灯。配制MTT时，建议使用PBS溶解，并在60℃水浴中辅以超声处理促进溶解。
四、MTT的添加
MTT添加量宜多不宜少，10µl即可。若某些孔加入MTT后立即呈蓝黑色，可能已受污染。加入MTT前，建议先在显微镜下观察，检查孔内细胞是否受细菌污染。
CCK8使用指南
1、将100ul细胞悬液接种至96孔板中，置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养。
2、每孔添加10ul CCK-8试剂。
3、将培养板放入培养箱中培养1-4小时。
4、在450nm波长下测定吸光度，参考波长设为600nm以上。
OD值的测量
细胞密度高时，测得的吸光度也偏高；细胞密度低时，吸光度偏低。此外，吸光度值与细胞状态相关，细胞状态不佳时吸光度值通常较低。细胞数量少或培养时间短时，OD值也偏低。若各孔差异明显，可能存在污染现象；如空白孔OD值异常高，很可能是受细菌污染影响。
为确保实验准确性，通常为每个浓度设置5-6个重复孔。在最终统计数据时，可排除一个最高值和一个最低值，或剔除可能出现的异常数值。这些异常数值可能与多种因素有关，如细胞污染、细胞死亡、培养液蒸发、MTT液的准确使用，以及37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育时间是否恰当（通常为1-4小时）。这些因素密切相关。
五、实验注意事项
1.建议控制细胞接种密度，尤其是悬浮细胞。每孔10000个左右的细胞数量较为合适，不宜过多。对于肿瘤细胞，更需避免过高的接种密度，宁少勿多，以确保实验结果的准确性和可靠性。
2.MTT和CCK-8实验本身属于相对粗略的实验方法，因此结果中出现小幅波动或误差属正常现象。
3.铺板时，务必确保细胞悬液充分混合。若长时间静置，需用枪头重复吹打几次以混合均匀。细胞分布不均匀会导致每孔细胞数量不一致，建议每接几个孔就进行混匀操作。移液枪操作需熟练，尽量避免误差。同时，吹散次数过多也会影响细胞活力，因此请尽快完成铺板操作。
4.进行吹打操作时，需注意细胞悬液总量不宜过多。过多悬液易造成污染，且细胞团不易被吹散。建议将细胞悬液控制在6-7ml左右。若悬液量过少，易产生大量气泡，影响实验进行。
5.吸液时，应将吸头置于悬浮液底部稍提起；吹液入管时，要保持接近液面，以避免产生气泡。
6.每块板加完后，记得晃动培养板，使细胞分散均匀。铺好板后静置2分钟，观察细胞分布均匀度及每孔细胞量是否大致一致。
7.避免边缘效应：在96孔板中，四周一圈的孔通常仅用作空白对照，不应培养细胞，否则这四排数据可能偏高或偏低。在最外侧一圈的孔中，务必添加水、PBS或培养液，以有效防止蒸发。
