一、泛素化概念
泛素化是指一种由76个氨基酸组成的小分子蛋白质，分子量约为8.5 kDa。泛素广泛存在于所有真核细胞中，其氨基酸序列高度保守，从酵母到人类仅有三个氨基酸的差异。在泛素化过程中，泛素在一系列酶的催化作用下共价结合于靶蛋白。此过程涉及三种泛素化酶的协同作用：
·E1 泛素激活酶：在人类基因组中编码有两种类型。
·E2 泛素结合酶：人类基因组编码大约40种。
·E3 泛素连接酶：人类基因组编码超过600种。
1.根据泛素向靶蛋白转移的具体结构域的不同，E3酶可以进一步分为三类：
·含有HECT结构域的E3s
·含有RING结构域的E3s
·U-box结构域的E3s
2.功能
①泛素化能够对靶蛋白进行标记，使其被蛋白酶体识别并降解。这一过程涉及多种酶系统、泛素分子及底物蛋白，确保细胞内的蛋白质质量控制和稳态。
②泛素-蛋白酶体系统（UPS）包括：泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3），以及去泛素化酶和蛋白酶体。该系统在细胞中负责大部分蛋白质的降解和回收工作，调节许多重要的生理过程。
3.泛素化降解蛋白质需要通过泛素化蛋白酶体来实现。
①蛋白酶体分布于细胞质和细胞核，是由10到20个亚基组成的蛋白质复合物。在生物体内，26S蛋白酶体普遍存在，发挥关键的降解功能。
②26S蛋白酶体包括20S核心蛋白酶体，负责大部分细胞内蛋白质的降解，并以两个19S调节颗粒作为调控单元，确保降解过程的高效性和特异性。
4.靶蛋白的泛素化降解是经过几个连续的过程来完成的
①泛素化过程依赖于ATP提供的能量，首先，泛素激活酶（E1）活化泛素分子。
②随即，E1将活化的泛素分子转移给泛素结合酶（E2）。
③泛素连接酶（E3）则负责将与E2结合的泛素分子连接至靶蛋白上，实现对靶蛋白的标记。
④最终，26S蛋白酶体特异识别此泛素化的底物蛋白，对其进行降解。此步骤是保证细胞内稳态和响应环境变化的机制之一。
二、如何检测蛋白是否泛素化？
1.免疫沉淀结合Western Blot分析
通过免疫共沉淀的方法，将某一特定蛋白及其结合的其他蛋白分离出来。借助SDS电泳和Western Blot分析，检测分离的蛋白，以明确特定位点（如赖氨酸残基）上的泛素化修饰。
2.Western Blot结合膜剥离技术
通过Western Blot分析所有可能的泛素化蛋白条带，拍照记录后进行膜剥离处理。再利用特定蛋白和泛素化位点的抗体进行反应，通过阳性条带的比较初步判断某一特定蛋白的特定位点是否发生了泛素化。这种方法能够在不切割条带的情况下，重复进行不同抗体检测。
3.体外泛素结合检测
将目标蛋白（可被泛素化的蛋白）基因转染至293细胞中，并通过大量表达和提纯目的蛋白来进行分析。或者从样品中直接提取内源性蛋白。与K63或K48连接的泛素链肽段孵育后，进行SDS电泳及泛素化抗体检测。此方法可以揭示具体哪个赖氨酸残基易于泛素化修饰。
4.体外泛素化反应分析
将待分析的目的基因转染至293细胞中，使其大量表达。在24小时后提取并分离目的蛋白。将蛋白A（待测泛素化的蛋白）与UBE1、UbeH13-Uev1a异二聚体复合物、HA-泛素及可能引起蛋白A泛素化的蛋白B共同孵育于反应缓冲液中。孵育后的产物通过免疫沉淀和Western Blot分析，明确定义为蛋白A泛素化修饰的E3连接酶。
三、文献
1.研究标题: "The miR-1185-2-3p-GOLPH3L Pathway Promotes Glucose Metabolism in Breast Cancer by Stabilizing p53-Induced SERPINE1" （《实验与临床癌症研究杂志》, 2021年发表, 影响因子: 2022年为12.685, 2021年为11.161）
2.交互验证：首先通过研究验证关键变量GOLPH3L对SERPINE1蛋白水平的影响，然后利用共免疫沉淀（co-IP）实验进一步证明二者的交互作用。如果条件允许，建议先通过蛋白质组学分析识别交互蛋白，再从中筛选与表型相关的分子，进行更深入的研究，这样的逻辑链条显得更加严谨合理。
3.蛋白稳定性：在论证蛋白的稳定性时，通常使用蛋白合成抑制剂CHX和蛋白酶体抑制剂MG132进行细胞处理。CHX处理后（确保不再有新蛋白合成）观察蛋白水平变化，而MG132处理后若水平不变（没有发生降解），则表明上游分子可能影响下游蛋白的降解；反之，若CHX处理后蛋白水平仍不变，则提示上游对下游蛋白的合成有影响。如此设计能为蛋白质稳定性提供更全面、充分的证明。
4.蛋白酶体的作用：蛋白酶体是对于细胞内蛋白质合成过程中错误折叠蛋白质以及其他被标记降解的蛋白的主要降解途径。在其降解之前，大多数蛋白质通常通过泛素化以进入泛素-蛋白酶体途径进行处理。精确理解此机制有助于进一步探索蛋白质质量控制在生物过程中的重要角色。
泛素化是指一种由76个氨基酸组成的小分子蛋白质，分子量约为8.5 kDa。泛素广泛存在于所有真核细胞中，其氨基酸序列高度保守，从酵母到人类仅有三个氨基酸的差异。在泛素化过程中，泛素在一系列酶的催化作用下共价结合于靶蛋白。此过程涉及三种泛素化酶的协同作用：
·E1 泛素激活酶：在人类基因组中编码有两种类型。
·E2 泛素结合酶：人类基因组编码大约40种。
·E3 泛素连接酶：人类基因组编码超过600种。
1.根据泛素向靶蛋白转移的具体结构域的不同，E3酶可以进一步分为三类：
·含有HECT结构域的E3s
·含有RING结构域的E3s
·U-box结构域的E3s
2.功能
①泛素化能够对靶蛋白进行标记，使其被蛋白酶体识别并降解。这一过程涉及多种酶系统、泛素分子及底物蛋白，确保细胞内的蛋白质质量控制和稳态。
②泛素-蛋白酶体系统（UPS）包括：泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3），以及去泛素化酶和蛋白酶体。该系统在细胞中负责大部分蛋白质的降解和回收工作，调节许多重要的生理过程。
3.泛素化降解蛋白质需要通过泛素化蛋白酶体来实现。
①蛋白酶体分布于细胞质和细胞核，是由10到20个亚基组成的蛋白质复合物。在生物体内，26S蛋白酶体普遍存在，发挥关键的降解功能。
②26S蛋白酶体包括20S核心蛋白酶体，负责大部分细胞内蛋白质的降解，并以两个19S调节颗粒作为调控单元，确保降解过程的高效性和特异性。
4.靶蛋白的泛素化降解是经过几个连续的过程来完成的
①泛素化过程依赖于ATP提供的能量，首先，泛素激活酶（E1）活化泛素分子。
②随即，E1将活化的泛素分子转移给泛素结合酶（E2）。
③泛素连接酶（E3）则负责将与E2结合的泛素分子连接至靶蛋白上，实现对靶蛋白的标记。
④最终，26S蛋白酶体特异识别此泛素化的底物蛋白，对其进行降解。此步骤是保证细胞内稳态和响应环境变化的机制之一。
二、如何检测蛋白是否泛素化？
1.免疫沉淀结合Western Blot分析
通过免疫共沉淀的方法，将某一特定蛋白及其结合的其他蛋白分离出来。借助SDS电泳和Western Blot分析，检测分离的蛋白，以明确特定位点（如赖氨酸残基）上的泛素化修饰。
2.Western Blot结合膜剥离技术
通过Western Blot分析所有可能的泛素化蛋白条带，拍照记录后进行膜剥离处理。再利用特定蛋白和泛素化位点的抗体进行反应，通过阳性条带的比较初步判断某一特定蛋白的特定位点是否发生了泛素化。这种方法能够在不切割条带的情况下，重复进行不同抗体检测。
3.体外泛素结合检测
将目标蛋白（可被泛素化的蛋白）基因转染至293细胞中，并通过大量表达和提纯目的蛋白来进行分析。或者从样品中直接提取内源性蛋白。与K63或K48连接的泛素链肽段孵育后，进行SDS电泳及泛素化抗体检测。此方法可以揭示具体哪个赖氨酸残基易于泛素化修饰。
4.体外泛素化反应分析
将待分析的目的基因转染至293细胞中，使其大量表达。在24小时后提取并分离目的蛋白。将蛋白A（待测泛素化的蛋白）与UBE1、UbeH13-Uev1a异二聚体复合物、HA-泛素及可能引起蛋白A泛素化的蛋白B共同孵育于反应缓冲液中。孵育后的产物通过免疫沉淀和Western Blot分析，明确定义为蛋白A泛素化修饰的E3连接酶。
三、文献
1.研究标题: "The miR-1185-2-3p-GOLPH3L Pathway Promotes Glucose Metabolism in Breast Cancer by Stabilizing p53-Induced SERPINE1" （《实验与临床癌症研究杂志》, 2021年发表, 影响因子: 2022年为12.685, 2021年为11.161）
2.交互验证：首先通过研究验证关键变量GOLPH3L对SERPINE1蛋白水平的影响，然后利用共免疫沉淀（co-IP）实验进一步证明二者的交互作用。如果条件允许，建议先通过蛋白质组学分析识别交互蛋白，再从中筛选与表型相关的分子，进行更深入的研究，这样的逻辑链条显得更加严谨合理。
3.蛋白稳定性：在论证蛋白的稳定性时，通常使用蛋白合成抑制剂CHX和蛋白酶体抑制剂MG132进行细胞处理。CHX处理后（确保不再有新蛋白合成）观察蛋白水平变化，而MG132处理后若水平不变（没有发生降解），则表明上游分子可能影响下游蛋白的降解；反之，若CHX处理后蛋白水平仍不变，则提示上游对下游蛋白的合成有影响。如此设计能为蛋白质稳定性提供更全面、充分的证明。
4.蛋白酶体的作用：蛋白酶体是对于细胞内蛋白质合成过程中错误折叠蛋白质以及其他被标记降解的蛋白的主要降解途径。在其降解之前，大多数蛋白质通常通过泛素化以进入泛素-蛋白酶体途径进行处理。精确理解此机制有助于进一步探索蛋白质质量控制在生物过程中的重要角色。
