肝细胞癌（HCC）是一种与慢性肝病和肝硬化密切相关的原发性肝脏恶性肿瘤。目前，免疫治疗和化疗是HCC患者最好的治疗选择，但大多数HCC患者在手术切除或消融后复发。因此，迫切需要更有效的治疗选择，而分子靶向治疗是一种很有前景的方法，可以提供更好的结果，降低全身毒性，减少副作用。
2024年8月，广州中医药大学研究团队在Advanced Science（IF=14.3）上发表了题为“Ponicidin Promotes Hepatocellular Carcinoma Mitochondrial Apoptosis by Stabilizing KEAP1-PGAM5 Complex”的研究成果。揭示了冬凌草乙素（Ponicidin）和KEAP1-PGAM5复合物的药理活性，对开发HCC和其他癌症的新治疗策略具有启示意义。
Highlights如下：
1）冬凌草乙素抑制HCC细胞的增殖和迁移；
2）冬凌草乙素有效抑制肿瘤生长并促进肿瘤细胞凋亡；
3）KEAP1在HCC组织中的表达高于癌旁组织，PGAM5的表达高于邻近正常组织，PGAM5在所有HCC阶段均上调；
4）机制上，冬凌草乙素靶向KEAP1并促进KEAP1-PGAM5复合体的形成，通过PGAM5激活胱氨酸依赖的线粒体途径，导致PGAM5的泛素化，从而导致线粒体损伤和ROS产生，促进线粒体凋亡，促进肿瘤细胞凋亡。
功能研究：体外，冬凌草乙素抑制HCC细胞的增殖和迁移；体内，抑制肿瘤生长并促进肿瘤细胞凋亡。
机制研究：
（1）冬凌草乙素以KEAP1为靶点
第一步，筛选冬凌草乙素的结合蛋白
为了证实冬凌草乙素对HepG2细胞的作用，合成生物素标记的冬凌草乙素，进行pulldown实验（图1a），银染色分析显示在70 KDa附近存在差异带（图1b-c），随后进行质谱分析鉴定，其中包括KEAP1蛋白（69 KDa）（图1d）。提示冬凌草乙素可能以KEAP1为靶点。
第二步，PGAM5与KEAP1相互作用
KEAP1蛋白是一种重要的调节蛋白，可以通过与其他蛋白相互作用来调节细胞内信号通路。基于此，推测KEAP1可能通过与其他蛋白的相互作用影响HCC。在文献检索和分析质谱数据后，发现PGAM5是一种与KEAP1相互作用的重要蛋白，pulldown实验显示可以被生物素标记的冬凌草乙素拉下（图1e）。
第三步，冬凌草乙素直接与KEAP1结合，影响PGAM5，在HCC中发挥药理作用
随后，进一步使用生物素标记的冬凌草乙素来识别冬凌草乙素与HuProtTMHuman Proteome Microarray上制备的重组蛋白的结合（图1f）。共鉴定出662个与冬凌草乙素结合的蛋白。冬凌草乙素对KEAP1蛋白具有很高的结合亲和力，而与PGAM5蛋白几乎没有结合（图1g-h）。此外，细胞学实验发现，当用冬凌草乙素处理时，KEAP1敲低导致MMP9蛋白表达显著降低。然而，敲除KEAP1后再用冬凌草乙素处理，对MMP9蛋白表达没有显著影响（图1i）。表明冬凌草乙素可能直接与KEAP1结合，影响PGAM5，从而在HCC中发挥药理作用。
图1 冬凌草乙素可能直接与KEAP1结合，影响PGAM5，从而在HCC中发挥药理作用（Ref. Fig 1/2/S3）
（2）研究KEAP1与PGAM5结合的区域
第一步，确定KEAP1与PGAM5结合的结构域及潜在氨基酸KEAP1可以与PGAM5结合，它们结合的结构基础尚不清楚（图2a）。PGAM5是磷酸甘油突变酶超家族的成员，包含一个PGAM结构域、TM结构域、MM结构域和一个与KEAP1相互作用的NxESGE基序（图2b）。而KEAP1则有NTR域、BTB域、IVR域、Kelch域和CTR域，Kelch域负责与PGAM5结合（图2c）。分子动力学模拟和轨迹聚类研究，以及结合AlphaFold3算法的预测结果，提示PGAM5上的Val78、Glu79、Ser80和Glu83氨基酸主要与KEAP1的Kelch结构域相互作用（图2d-g）。
第二步，确定KEAP1与PGAM5结合的氨基酸
为了更好地了解KEAP1和PGAM5相互作用的分子机制，依次进行结构生物学实验、ITC实验、晶体学实验，暗示Glu79可能在ESGE基序与KEAP1结合的过程中起着至关重要的作用（图2h-i）。随后合成一个基于20-mer肽的E79A突变体，并进行ITC实验。显示E79A突变体的结合亲和力明显降低（图2j）。表明Glu79是Kelch与PGAM5结合的关键残基。
图2 Glu79是Kelch与PGAM5结合的关键残基（Ref. Fig 3/4）
（3）研究冬凌草乙素在KEAP1与PGAM5互作中的调控作用
第一步，冬凌草乙素结合KEAP1，促进KEAP1与PGAM5互作，促进PGAM5的泛素化
为了研究冬凌草乙素的特异性靶点，体外纯化KEAP1的Kelch结构域和∆54‐PGAM5（氨基酸编号从54到289）蛋白，以探索在冬凌草乙素存在下的结合能力。通过SPR技术验证了Kelch和冬凌草乙素的结合（图3a），而∆54‐PGAM5未发现与冬凌草乙素结合（图3b）。CETSA检测显示，添加冬凌草乙素后，KEAP1的残留量增加（图3c）。Co-IP验证KEAP1与PGAM5相互作用，显示加入冬凌草乙素后，KEAP1与PGAM5互作增加（图3d）。EMSA结果显示冬凌草乙素可结合Kelch并促进其与PGAM5的结合（图3e）。KEAP1是E3连接酶，可将泛素转移到与KEAP1互作蛋白质的赖氨酸残基上，导致蛋白质泛素化和降解。因此，研究KEAP1是否调控PGAM5的泛素化。IP-WB结果显示，冬凌草乙素可增加PGAM5的泛素化（图3f）。表明冬凌草乙素可以结合KEAP1，从而促进KEAP1与PGAM5的相互作用，促进PGAM5的泛素化。
第二步，冬凌草乙素通过影响KEAP1的Kelch结构域的变构来稳定Keap1与PGAM5的结合
进一步研究冬凌草乙素对KEAP1与PGAM5相互作用的影响。Autodock Vina分子对接模拟发现冬凌草乙素能够稳定结合KEAP1的Kelch结构域（图3g）。表明冬凌草乙素选择性地结合KEAP1而不是PGAM5。根据RMSF曲线和晶体结构数据，暗示冬凌草乙素与KEAP1上的Ile559和Leu557结合。结合KEAP1‐PGAM5和冬凌草乙素‐KEAP1‐PGAM5复合物的具体构象研究和构象变化主成分分析（PCA）分析结果表明冬凌草乙素可以影响Kelch结构域的变构结构，促进KEAP1与PGAM5结合的稳定性（图3h-i）。
第三步，冬凌草乙素促进KEAP1与PGAM5互作口袋的收紧，并稳定KEAP1-PGAM5复合物的形成
进一步研究KEAP1-PGAM5结合冬凌草乙素后相互作用口袋的变化。吉布斯自由能景观分析表明冬凌草乙素的结合改变了KEAP1 - PGAM5复合物的构象分布（图3j）。独立梯度模型（IGM）分析发现含有范德华相互作用和氢键的相互作用区域在冬凌草乙素结合后被扩大（图3k）。采用MM/GBSA方法计算KEAP1与PGAM5之间的结合能，与冬凌草乙素结合后结合能显著增加（图3l）。自由能分解分析发现PGAM5中参与KEAP1-PGAM5相互作用的残基数量显著增加，其中PGAM5中的Trp58提供高而稳定的结合能（图3m-o）。表明，冬凌草乙素的结合增强了KEAP1与PGAM5的结合。
图3 冬凌草乙素促进KEAP1与PGAM5互作，稳定KEAP1-PGAM5复合物，促进PGAM5的泛素化（Ref. Fig 4/5/6）
结论：研究者在体内外实验发现冬凌草乙素有效抑制肿瘤生长并促进肿瘤细胞凋亡。利用生物素标记的冬凌草乙素进行pulldown和HuProtTM人类蛋白质组微阵列，发现冬凌草乙素靶向KEAP1并促进KEAP1-PGAM5复合物的形成，从而导致PGAM5泛素化。冬凌草乙素通过PGAM5激活半胱氨酸依赖性线粒体途径，导致线粒体损伤和ROS产生，从而促进HepG2细胞线粒体凋亡。利用分子动力学模拟验证冬凌草乙素与KEAP1-PGAM5复合物的结合。基于深度动力学模拟发现冬凌草乙素可以诱导KEAP1-PGAM5相互作用口袋收紧，从而稳定蛋白复合物的形成。为基于KEAP1-PGAM5复合物机制的冬凌草乙素抗肝癌特性提供了见解。
本文冬凌草乙素小分子筛选蛋白组芯片技术，由广州基云生物提供。
中药小分子筛选蛋白组芯片技术服务内容：
中药小分子筛选蛋白组芯片技术
2024年8月，广州中医药大学研究团队在Advanced Science（IF=14.3）上发表了题为“Ponicidin Promotes Hepatocellular Carcinoma Mitochondrial Apoptosis by Stabilizing KEAP1-PGAM5 Complex”的研究成果。揭示了冬凌草乙素（Ponicidin）和KEAP1-PGAM5复合物的药理活性，对开发HCC和其他癌症的新治疗策略具有启示意义。
Highlights如下：
1）冬凌草乙素抑制HCC细胞的增殖和迁移；
2）冬凌草乙素有效抑制肿瘤生长并促进肿瘤细胞凋亡；
3）KEAP1在HCC组织中的表达高于癌旁组织，PGAM5的表达高于邻近正常组织，PGAM5在所有HCC阶段均上调；
4）机制上，冬凌草乙素靶向KEAP1并促进KEAP1-PGAM5复合体的形成，通过PGAM5激活胱氨酸依赖的线粒体途径，导致PGAM5的泛素化，从而导致线粒体损伤和ROS产生，促进线粒体凋亡，促进肿瘤细胞凋亡。
功能研究：体外，冬凌草乙素抑制HCC细胞的增殖和迁移；体内，抑制肿瘤生长并促进肿瘤细胞凋亡。
机制研究：
（1）冬凌草乙素以KEAP1为靶点
第一步，筛选冬凌草乙素的结合蛋白
为了证实冬凌草乙素对HepG2细胞的作用，合成生物素标记的冬凌草乙素，进行pulldown实验（图1a），银染色分析显示在70 KDa附近存在差异带（图1b-c），随后进行质谱分析鉴定，其中包括KEAP1蛋白（69 KDa）（图1d）。提示冬凌草乙素可能以KEAP1为靶点。
第二步，PGAM5与KEAP1相互作用
KEAP1蛋白是一种重要的调节蛋白，可以通过与其他蛋白相互作用来调节细胞内信号通路。基于此，推测KEAP1可能通过与其他蛋白的相互作用影响HCC。在文献检索和分析质谱数据后，发现PGAM5是一种与KEAP1相互作用的重要蛋白，pulldown实验显示可以被生物素标记的冬凌草乙素拉下（图1e）。
第三步，冬凌草乙素直接与KEAP1结合，影响PGAM5，在HCC中发挥药理作用
随后，进一步使用生物素标记的冬凌草乙素来识别冬凌草乙素与HuProtTMHuman Proteome Microarray上制备的重组蛋白的结合（图1f）。共鉴定出662个与冬凌草乙素结合的蛋白。冬凌草乙素对KEAP1蛋白具有很高的结合亲和力，而与PGAM5蛋白几乎没有结合（图1g-h）。此外，细胞学实验发现，当用冬凌草乙素处理时，KEAP1敲低导致MMP9蛋白表达显著降低。然而，敲除KEAP1后再用冬凌草乙素处理，对MMP9蛋白表达没有显著影响（图1i）。表明冬凌草乙素可能直接与KEAP1结合，影响PGAM5，从而在HCC中发挥药理作用。
图1 冬凌草乙素可能直接与KEAP1结合，影响PGAM5，从而在HCC中发挥药理作用（Ref. Fig 1/2/S3）
（2）研究KEAP1与PGAM5结合的区域
第一步，确定KEAP1与PGAM5结合的结构域及潜在氨基酸KEAP1可以与PGAM5结合，它们结合的结构基础尚不清楚（图2a）。PGAM5是磷酸甘油突变酶超家族的成员，包含一个PGAM结构域、TM结构域、MM结构域和一个与KEAP1相互作用的NxESGE基序（图2b）。而KEAP1则有NTR域、BTB域、IVR域、Kelch域和CTR域，Kelch域负责与PGAM5结合（图2c）。分子动力学模拟和轨迹聚类研究，以及结合AlphaFold3算法的预测结果，提示PGAM5上的Val78、Glu79、Ser80和Glu83氨基酸主要与KEAP1的Kelch结构域相互作用（图2d-g）。
第二步，确定KEAP1与PGAM5结合的氨基酸
为了更好地了解KEAP1和PGAM5相互作用的分子机制，依次进行结构生物学实验、ITC实验、晶体学实验，暗示Glu79可能在ESGE基序与KEAP1结合的过程中起着至关重要的作用（图2h-i）。随后合成一个基于20-mer肽的E79A突变体，并进行ITC实验。显示E79A突变体的结合亲和力明显降低（图2j）。表明Glu79是Kelch与PGAM5结合的关键残基。
图2 Glu79是Kelch与PGAM5结合的关键残基（Ref. Fig 3/4）
（3）研究冬凌草乙素在KEAP1与PGAM5互作中的调控作用
第一步，冬凌草乙素结合KEAP1，促进KEAP1与PGAM5互作，促进PGAM5的泛素化
为了研究冬凌草乙素的特异性靶点，体外纯化KEAP1的Kelch结构域和∆54‐PGAM5（氨基酸编号从54到289）蛋白，以探索在冬凌草乙素存在下的结合能力。通过SPR技术验证了Kelch和冬凌草乙素的结合（图3a），而∆54‐PGAM5未发现与冬凌草乙素结合（图3b）。CETSA检测显示，添加冬凌草乙素后，KEAP1的残留量增加（图3c）。Co-IP验证KEAP1与PGAM5相互作用，显示加入冬凌草乙素后，KEAP1与PGAM5互作增加（图3d）。EMSA结果显示冬凌草乙素可结合Kelch并促进其与PGAM5的结合（图3e）。KEAP1是E3连接酶，可将泛素转移到与KEAP1互作蛋白质的赖氨酸残基上，导致蛋白质泛素化和降解。因此，研究KEAP1是否调控PGAM5的泛素化。IP-WB结果显示，冬凌草乙素可增加PGAM5的泛素化（图3f）。表明冬凌草乙素可以结合KEAP1，从而促进KEAP1与PGAM5的相互作用，促进PGAM5的泛素化。
第二步，冬凌草乙素通过影响KEAP1的Kelch结构域的变构来稳定Keap1与PGAM5的结合
进一步研究冬凌草乙素对KEAP1与PGAM5相互作用的影响。Autodock Vina分子对接模拟发现冬凌草乙素能够稳定结合KEAP1的Kelch结构域（图3g）。表明冬凌草乙素选择性地结合KEAP1而不是PGAM5。根据RMSF曲线和晶体结构数据，暗示冬凌草乙素与KEAP1上的Ile559和Leu557结合。结合KEAP1‐PGAM5和冬凌草乙素‐KEAP1‐PGAM5复合物的具体构象研究和构象变化主成分分析（PCA）分析结果表明冬凌草乙素可以影响Kelch结构域的变构结构，促进KEAP1与PGAM5结合的稳定性（图3h-i）。
第三步，冬凌草乙素促进KEAP1与PGAM5互作口袋的收紧，并稳定KEAP1-PGAM5复合物的形成
进一步研究KEAP1-PGAM5结合冬凌草乙素后相互作用口袋的变化。吉布斯自由能景观分析表明冬凌草乙素的结合改变了KEAP1 - PGAM5复合物的构象分布（图3j）。独立梯度模型（IGM）分析发现含有范德华相互作用和氢键的相互作用区域在冬凌草乙素结合后被扩大（图3k）。采用MM/GBSA方法计算KEAP1与PGAM5之间的结合能，与冬凌草乙素结合后结合能显著增加（图3l）。自由能分解分析发现PGAM5中参与KEAP1-PGAM5相互作用的残基数量显著增加，其中PGAM5中的Trp58提供高而稳定的结合能（图3m-o）。表明，冬凌草乙素的结合增强了KEAP1与PGAM5的结合。
图3 冬凌草乙素促进KEAP1与PGAM5互作，稳定KEAP1-PGAM5复合物，促进PGAM5的泛素化（Ref. Fig 4/5/6）
结论：研究者在体内外实验发现冬凌草乙素有效抑制肿瘤生长并促进肿瘤细胞凋亡。利用生物素标记的冬凌草乙素进行pulldown和HuProtTM人类蛋白质组微阵列，发现冬凌草乙素靶向KEAP1并促进KEAP1-PGAM5复合物的形成，从而导致PGAM5泛素化。冬凌草乙素通过PGAM5激活半胱氨酸依赖性线粒体途径，导致线粒体损伤和ROS产生，从而促进HepG2细胞线粒体凋亡。利用分子动力学模拟验证冬凌草乙素与KEAP1-PGAM5复合物的结合。基于深度动力学模拟发现冬凌草乙素可以诱导KEAP1-PGAM5相互作用口袋收紧，从而稳定蛋白复合物的形成。为基于KEAP1-PGAM5复合物机制的冬凌草乙素抗肝癌特性提供了见解。
本文冬凌草乙素小分子筛选蛋白组芯片技术，由广州基云生物提供。
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