回复：转基因食品的最大问题是慢性剧毒持久毒害人体健康

《评估从苏云金芽孢杆菌Cry1Ia、Cry10Aa和Cry1Ba6重组孢子体复合物对瑞士小鼠的细胞毒性、遗传毒性和血液毒性》
Evaluation of Cytotoxicity, Genotoxicity and Hematotoxicity of the Recombinant Spore-Crystal Complexes Cry1Ia, Cry10Aa and Cry1Ba6 from Bacillus thuringiensis in Swiss Mice
摘要：苏云金芽孢杆菌(Bt)的杀虫性能长期以来一直被用作昆虫防治商业喷雾配方中的孢子结晶。最近，在许多不同的植物中都克隆出了一些BT-内毒素基因。对三种孢子晶体内毒素：Bt Cry1Ia、Bt Cry10Aa和Bt Cry1Ba6从苏云芽孢杆菌提取进行毒理学评价，以了解其对小鼠血液系统和遗传物质的不利影响。这三种孢子晶体对棉铃象鼻虫有毒性作用，是棉花作物中最具攻击性的害虫之一。Cry1Ia、Cry10Aa和Cry1Ba6对有一些血液学指标，特别是与Cry1Ia和Cry1Ba6有关，分别对红细胞和淋巴血统起作用。因此,尽管这种副作用的概况可以与其的高水平的暴露有关,这不是常见的环境,结果表明,这些Bt孢子晶体不是对老鼠无害的，表明每个孢子晶体内毒素表现出毒性特征，并可单独研究。
内毒素是由细菌释放出来的，在被昆虫的幼虫吸收后，在其中肠的碱性pH中裂开，变成有毒的。这些片段与幼虫的中肠内的细胞受体结合，导致细胞膜上的气孔，从而导致细胞死亡。再过几天，幼虫的肠子就会被分解，导致幼虫死于败血症或空洞症。Bt孢子晶体在整个生态系统中复制和分散的能力引起了人们的关注，这主要是由于它们在生物控制方面的广泛应用，以及现在在转基因植物上。因此，评估Bt与非目标生物之间的潜在相互作用是很重要的。
结果与讨论
表1显示的致突变试验结果。Cry10aa（1×109 孢子/kg）内毒素测试增加了微核的水平。
表1：
红霉素有关(表2),血红蛋白（HGB）和红细胞压积（HCT）与对照组相比，试验组在平均红细胞血红蛋白（MCH）显著降低（P＜0.01）。除了Cry1Ba6(4×108孢子/kg),试验组也减少了平均微粒血红蛋白浓度(MCHC)。Cry10Aa(5×109孢子/kg),Cry10Aa(1×1010孢子/kg),和所有Cry1Ba6试验组也显著降低平均微粒体积(MCV)值,而Cry1Ia(4×109孢子/公斤)增加红细胞分布宽度(RDW)以上引用值(p < 0.01)。（各项指标紊乱，笔者注）
表2：红血球参数对比

在白细胞像分析：与对照组相比，Cry10Aa（1×1010孢子／kg），淋巴细胞百分比显著降低；Cry1Ba6（4×108孢子／kg）和cry1ba6（2×109孢子／kg），显著降低中性粒细胞+单核细胞数目；和cry1ba6（4×109孢子／kg），两者均显著降低（表3）。
表3：白细胞参数

血小板计数方面：几乎所有的试验组平均血小板体积(MPV)和血小板值大细胞比率(P-LCR)显著增加，而Cry10Aa(1×109孢子/kg)和所有Cry1Ia试验组显著增强血小板分布宽度(PDW)(表4)。
表4：

《评估人类胃肠道中的转基因植物DNA的生存》
Assessing the survival of transgenic plant DNA in the human gastrointestinal tract
摘要：在人类饮食中加入转基因植物引起了人们对转基因植物可能从转基因植物转移到肠道菌群和肠上皮细胞的担忧。饮食中的转基因植物DNA在人体肠道内(存活的)持久性是未知的。在这里，我们研究在人类回肠造口术患者小肠转基因大豆的转基因EPSPS生存（即个人在回肠末端切除和食糜从身体转移到通过造口结肠造瘘袋）。通过小肠存活的转基因数量因人而异，在一个个体的气孔中恢复最多为3.7%。7名回肠造术者中有3人在参与这些实验前显示了从转基因大豆到小肠道菌群的低频率基因转移的证据。
人类对转基因植物的消费引发了一个问题，即转基因是否能被肠道微生物群所吸收。特别令人担忧的是基因可能转移抗生素耐药性，导致哺乳动物病原体的增加，这些病原体对抗菌剂有抗药性。在这里，我们评估了在食用转基因大豆的人类志愿者小肠内的转基因生存。虽然一小部分转基因DNA通过胃和小肠存活下来，但所有的转基因DNA都在结肠内降解。从转基因大豆到小肠道菌群的低频率基因转移有一些提示，但在受试者参与这些实验的过程中并未出现。
结果
DNA在回肠造口术患者中生存
为了评估胃和小肠中转基因DNA的存活情况，我们通过定量竞争(QC)PCR，给7个回肠造口术患者提供了一种含有转基因大豆的膳食，然后将其量化的目标DNA序列在消化系统中进行量化。在回肠造口术患者中，末端回肠是切除的，消化系统从身体转移到结肠造瘘袋。转基因大豆中的转基因大豆是EPSPS。总EPSPS结构为2,266碱基对(bp)，并编码5 -烯醇丙酮酸- 3 -磷酸合成酶(EPSPS)。PCR数据的例子和qc-PCR对EPSPS的量化，如图1所示，完整的qc - PCR数据集显示在表1中。
图1：人体肠道转基因EPSPS检测

解读：箭头位置180bp，在180bp亮灯就是转基因EPSPS反应阳性，表示转基因转移到受试者的肠道细菌中，亮灯的泳道有3/4/6/7/8/14/15/16/17/18/19/20/21/22/23/24，表明受试者1/4/6/7号转基因EPSPS呈阳性反应，受试者5号在180分钟和210分钟基本呈现阳性反应。
表1：在回肠造口术患者的小肠中的转基因EPSPS生存情况表

解读：通过表1可以看到，除了3号受试者在小肠中零星检测出片段以外，其他6个受试者在不同的时间均能在小肠检测出完整的转基因EPSPS，证明转基因EPSPS在小肠中成活，测出平均时长在120分钟之后，最长时间在360分钟时仍能测出小肠中完整的转基因EPSPS。
这顿饭喂给回肠造口术患者含有3×1012份转基因拷贝和消化标记PEG4000，来确定食物通过小肠的比例。超过60%的标记在六个受试者的食糜中被恢复(图2)。转基因(表1和图2)在所有七个受试者中被恢复,虽然通过食糜率和该核酸总回收率通过个人之间是高度可变的,从1011份转基因(或3.7%的180个基点epsps地区餐)在受试者4和受试者3中只有105份。
图2：

为了确定我们是否能检测到完整的EPSPS基因，我们受到食糜PCR扩增的引物对，整个开放阅读框。全长基因的检测样本中含有至少104份180bp片段每毫克干重的食靡(表1),但因为这样的DNA分子可能是由PCR- EPSPS重组的片段,谨慎对待全长基因完好无损的结论。
我们评估了转基因大豆的差别生存和在转基因大豆中的基因，凝集素基因Le111,12。Le1和EPSPS基因的持久性相似(图3)，表明转基因和大豆DNA的降解速度相近。
图3：le1和EPSPS基因降解速度对比

为了确定难消化的标记PEG 4000是否影响了回肠造口术患者小肠内的DNA存活，我们评估了这种聚合物的能力来抑制DNA活性。4%(wt / vol)，相当于在含有转基因大豆的膳食中PEG 4000的浓度，运输标记似乎略微提高了DNA降解率(图4略)。
人类的DNA在完整的胃肠道中存活
我们将含有转基因大豆的试验膳食喂给12名人类志愿者(完整的胃肠道)，并通过PCR对粪便中转基因的存在进行量化。对所有志愿者来说，90 - 98%的难消化的标记物在粪便中被发现，但没有检测到转基因。这并不是PCR抑制的结果，因为PCR在PCR中使用了400份transgene(数据未显示)，PCR扩增了一种180 bp的产品。因此，尽管转基因EPSPS基因可以通过胃肠蠕动者的小肠存活下来，但它在大肠内是完全降解的(虽然DNA碎裂了，但碎解后的小DNA仍可能通过肠道进入血液，运输到身体各器官组织中，有待实验证实，笔者注)。

细胞结构图：
光面内质网=滑面内质网
核染质=染色质

细胞核的结构图：可见多条染色质(绿色)

人类细胞染色质--X型，可见DNA双螺旋结构

再次重发；

再次重发：

转基因植物:从Bt玉米根系分泌物中渗出的杀虫毒素
Transgenic plants: Insecticidal toxin in root exudates from Bt corn
Bt玉米是一种转基因玉米(Zea mays)，它通过基因改造来表达从细菌芽孢杆菌中提取的杀虫毒素，以杀死在这些植物上生长的鳞翅目害虫。在这里，我们发现bt毒素被从Bt玉米根系分泌物释放到根际土壤中。
杀虫毒素是由苏云金芽孢杆菌亚种产生的，并在土壤中保持活性。它在土壤中快速和紧密地结合在粘土和腐殖酸上。这种被束缚的毒素保留了它的杀虫性，并通过与土壤颗粒的结合保护了它不被微生物降解，在土壤至少可以保持持234天(研究时间最长)不变，这是由杀虫生物测定法所决定的。不同于细菌，以前体形式产生毒素，Bt玉米含有插入截断的Cry1Ab基因编码的活性毒素。
在实验室研究中，帝王蝶幼虫(Danaus plexippus)的被杀死，原因是它以牛奶草(阿斯克勒皮亚(Asclepias curassavica))为食，这是一种从转基因玉米中被花粉污染的带有花粉的转基因玉米，它表达了苏云金芽孢杆菌的cry1Ab基因。对绿色草蛉（Chrysoperla吉祥草），这是害虫欧洲玉米螟（Ostrinia nubilalis）的天敌昆虫，被摄入饲养Bt玉米的杀死。
我们研究了Bt玉米(nk4640bt)和无cry1Ab基因在琼脂上的表面杀菌的种子。这些幼苗被放在塑料筛网上(6毫米网眼)，其中，由胚乳水解产品减少污染，被悬浮在超过200毫升的霍格兰溶液中，在4升的烧杯中，用铝箔覆盖，在植物的顶部到达的18到20天之后，它被移除。7,15和25天后的生长室(26°C,12 小时光暗周期),用新鲜溶液代替无土培养基，并进行了分析
培养基中(每株平均105毫克蛋白质)的总蛋白质是由Lowry法测定的。主要迁移带在SDS-PAGE（凝胶电泳）对应的相对分子质量为66000的位置（66K），表明与Cry1Ab蛋白相同，显而易见的只从7和15天后在Bt玉米渗出液中被发现。虽然几个相对分子质量小蛋白条带出现在转基因Bt玉米和非转基因玉米的分泌物中。通过免疫测定，我们证实了Bt玉米分泌物中毒素的存在（来自缅因州的EnviroLogix检测限值* 十亿分之一），并证实使用它在烟草喇叭虫幼虫的杀虫剂生物测定中很活跃。
幼虫放置在含有从Bt玉米中提取的Bt玉米分泌物中后2-3天后开始死亡，5天后死亡90-95%(50%的幼虫，LC50为5.2 mg蛋白)。从非bt玉米中获得的分泌物没有免疫反应或幼虫死亡率。生长25天后,当媒介不再是无菌的(为论证在各种微生物培养基),66k带已经消失了,虽然有几个新的相对分子质量小的蛋白条带,免疫和杀虫试验均为阴性，表明微生物可能和玉米，有溶解毒素的蛋白酶。
从随机选择的试管中抽取出幼苗移植到试管中无菌或非无菌土壤的管根际土壤样本，并与提取缓冲液(EnviroLogix)离心分离。我们用免疫学和杀幼虫化验分析了这些上清液，发现这些都是(转基因)阳性的(转基因玉米幼苗种植过的土壤样本，提取土壤中的上清液，检测到转基因呈阳性，幼苗根系分泌物渗入了土壤，并且分泌物是转基因的，笔者注)，即使从Bt玉米中获得的样本是在生长了25天之后，(25天后分泌物依然保持活性)(100%死亡率;LC50 41.6 mg蛋白/土壤管），但对非bt玉米(分泌物检测)为阴性。此外，根际土壤颗粒的悬浮培养直接放置在生物介质引起的死亡率与上清液相同。(土壤颗粒中还含大量分泌物，带着毒性，死亡率与上清液一样，笔者注)
虽然根际土壤中蛋白酶的浓度接近每g土壤95毫克，但提取缓冲液中实际毒素的浓度明显太低，无法通过sds - page检测。这些结果与早期的研究结果一致，表明毒素与表面活性的土壤颗粒紧密结合，而被束缚的毒素保留其杀虫活性，并受到这种与结合抗生物降解的保护。（转基因玉米的根部分泌物转基因bt毒素长久土壤，久久不降解，一直保持转基因活性）
在Bt玉米作物生长过程中，从根部释放到土壤中的Bt毒素会增加在抽雄中从花粉中引入土壤的毒素和收获后植物残体的渗入。

摄入异质(噬菌体M13)DNA在胃肠道中短暂存活，并进入小鼠的血液中
摘要：哺乳动物胃肠道(GI)的上皮细胞衬里是阻碍吸收外来DNA的一个紧密的屏障，还是这种外来的DNA可以渗透到有机体中?？我们走近这个问题，通过吸管喂食小鼠圆形或线性化的双链噬菌体M13 DNA进行了研究，或者将M13 DNA添加到小鼠的食物中，这些老鼠的粪便分泌物以前被证明没有这种DNA。在不同的餐后时间，动物的粪便通过Southern或dot blot杂交或聚合酶链反应(PCR)检测m13 DNA序列。在Southern杂交中，m13 DNA片段的大部分在200~400 bp(碱基对)之间的尺寸范围内。在PCR分析中，合成的寡脱氧核糖核苷酸引物在M13 DNA分子上是有间隔的，这样可以确定持续M13 DNA片段的大小。我们也在喂食M13 DNA后的不同时间从全血中提取DNA，或从动物的血液细胞中提取DNA，并准备通过斑点杂交或PCR检测这些DNA的存在。M13 DNA片段被发现在1和7小时之间餐后的小鼠的粪便中。通过PCR分析，检测出712,976和1692个bp片段。在血液DNA中，PCR在喂食后2到6小时内发现了472bp的DNA片段。斑点杂交或Southern印迹杂交显示M13 DNA在2和4小时，但不在1、8或24小时后喂养。这个DNA被证明是脱氧核糖核酸酶敏感的。M13 DNA在血细胞和血清中均有发现，分析了由粪便或血液中PCR扩增的一段约400bp的DNA片段，并分析了其核苷酸序列，发现与真正的M13 DNA完全相同，除了几个偏差。M13 DNA在喂食前或在1小时之前，或在进食后7小时后，不能在粪便或动物血液中检测到。这些对照证实了结果的正确性，也证明了鼠的消化道被噬菌体M13所占领的可能性。此外，M13 DNA阳性细菌菌落从来没有从摄入M13 DNA的动物粪便中分离出来。重建的实验结果显示，在小鼠胃肠道中可以检测到2-4%的口服M13 DNA。从血液中提取的M13 DNA的比例大约在0.01%到0.1%之间。
介绍
在一些生物系统中，哺乳动物细胞可以吸收外来DNA并将其融入到他们的基因组中。在过去，我们研究了这种机制的某些方面，研究了腺病毒DNA与哺乳动物细胞基因组的整合(Doerfler 1968;Groneberg et al.1975;Doerfler et al. 1983;Jessberger et al . 1989;Orend et al . 1994;Tatzelt et al . 1993年)。在生物体内，由于部分或完全消化的营养成分的不断流动，胃肠道(胃肠道)会不断地暴露于外来DNA中。胃肠道上皮衬里的细胞表现出高翻转的原因有很多，可能不是所有的都是机械的。目前尚不清楚哺乳动物的DNA是否能存活，至少在一定程度上是，消化系统的酶系统，到胃肠道的细胞可以吸收外来的DNA，或者是来自营养物质的DNA片段是否能够从胃肠道进入血液循环。
在哺乳动物消化道中核酸的命运。《反刍动物》(McAllan 1980,1982;风暴et al. 1983)和老鼠(Maturin and Curtiss 1977)，在几年前进行了首次调查。这些方法的灵敏度有限，无法排除微量完整的DNA片段在哺乳动物肠道中存活的可能性。
虽然现有的数据倾向于认为进入胃肠道的外DNA序列不能通过未经消化的，我们已经用目前的方法重新研究了这个问题。最严格的测试包括纯圆形或线性双链DNA的管理，直接或添加到食物颗粒中，在喂食后的不同时间对小鼠的粪便排泄。我们也从血液中提取DNA，从分离的血细胞和血清中提取DNA，并在喂食后的不同时间对其进行检测。
在本报告中，我们证明了1692bp长度的M13 DNA片段在小鼠胃肠道中存活了下来。M13mp18基因组含有7250个bp。在M13 DNA吸管喂养过程中，动物将异体DNA片段在1-7小时后排出体外。当M13 DNA被添加到食物颗粒时，在粪便中也会发现DNA片段。粪便分泌物中M13的DNA已被Southern和dot blot杂交识别，并通过聚合酶链反应(PCR)。在没有得到噬菌体DNA的对照组动物粪便排泄物中，从未检测到M13 DNA。我们还研究了从血液循环中提取的DNA，以获得M13 DNA的外观和持久性。在59种不同的动物的血液中检测到的M13 DNA片段长度为472 bp，在喂食后的2到6小时之间检测。
研究结果直接表明，哺乳动物摄入的外源DNA可以通过胃肠道系统存活，并能进入血液。
在小鼠粪便中检测到M13 DNA的过程
DNA印迹杂交分析的结果从小鼠粪便样本收集1-7小时后喂养,揭示了M13的DNA片段存在的长度< 200和1500 bp的之间(图1 a、b)。在喂食后24小时,M13 DNA不再被发现。共电泳标记DNA片段为碎片大小的估计提供了规模。很明显，在1和7小时之间喂养M13 DNA后，这个外来的DNA在粪便中排出。在一些实验中，M13mpl8 DNA之前用EcoRI的卵裂线将其线性化。分析结果与图1所示类似。
图1，电泳和印迹法分析小鼠粪便M13 DNA

这些结果表明，未受保护的双链、圆形或线性M13 DNA直接给成年小鼠可以抵抗胃肠道的降解，在喂食后1-7小时的粪便中可以检测到，尽管是相当分散的形式。在50μg(图1)或10μg(未显示数据)M13 DNA被喂给小鼠时得到了类似的结果。在喂食之前，实验动物粪便中没有M13 DNA的痕迹。
扩增M13 mp18 DNA片段在粪便中的PCR
PCR方法在小鼠粪便中检测M13 DNA的应用，提供了一种方法来评估这种DNA在胃肠道中的存活。通过选择引物寡脱氧核糖核苷酸对P1和P2，在M13 DNA分子上分别定位712个核苷酸(图2C)，确定了M13 DNA存活的餐后时间过程。图2a所示的数据显示，在喂食之前，小鼠胃肠道中没有微量M13 DNA。在喂养M13 DNA后1.5 小时到6 小时之间，可以检测到所选引物长度的片段(图2A)。用DNase提取的粪便提取物对DNA的处理消除了所有放大产物的痕迹。阳性反应的扩增产物也被杂交到真正的32P标记的M13 DNA，这是由Southern印迹杂交所显示的。
图2：M13mp18的DNA片段在粪便中的PCR

我们下一个选择的引物位置更远(图2C)，以评估M13 DNA片段最大长度的抗胃肠道降解，仍然可以从粪便中恢复。PCR分析结果显示，712 bp(引物对P1/P2)，976 bp(引物对P1/P3，图2c图)和1692 bp(引物对P1/P4，图2C图)可以检测到(图2B)。
其他数据(未显示)表明，即使只吃了10 μg的M13mp18 DNA，M13的DNA信号也可以4-6小时后从粪便DNA中提取出来，并通过Southern杂交和PCR扩增。
点状杂交技术dot blot
我们也应用dot blot杂交技术检测小鼠粪便中M13 DNA。图3a中所示的结果表明，在进食后1-7小时，该方法可以很容易地检测到M13 DNA。无M13 DNA或在模拟喂养实验中未获得M13 DNA的小鼠的粪便中没有M13 DNA(图3 A,B)，图3 A,B，两项独立实验的结果。

我们还试图量化在粪便排泄中存活的口服DNA的比例。重组实验的结果表明，原本可以从粪便中提取的DNA的2-4%的顺序可以从粪便中提取出来(见图3A)。
在一些实验中，将M13 DNA的50μg添加到提供给小鼠的食物颗粒中。显然，在这种喂食机制下，无法确定摄入M13 DNA的确切时间。因此，我们在提供M13 DNA处理的食物颗粒后，记录了粪便收集的时间。通过使用dot blot杂交方法，可以在小鼠的粪便中检测到M13 DNA，在2、4.5、6、8小时的粪便中检测到M13的DNA，但不是颗粒暴露24小时(未显示数据。
我们得出的结论是，斑点杂交程序允许在小鼠的粪便中检测M13 DNA，直接用吸管喂食M13 DNA，或在食物颗粒中进行检测。粪便排泄是M13 DNA在1到7小时之间的阳性，在喂食后从1到4小时明显。在后期，M13 DNA就不能再被检测到。
从全血、血细胞或小鼠血清中恢复M13 DNA
到目前为止的结果的一个合乎逻辑的扩展是在小鼠的胃肠道外寻找M13 DNA。从血液中提取DNA，从血细胞中提取DNA，从动物血清中提取DNA。在一些实验中，30个μg或10个μg的M13 DNA被喂食，在没有接受噬菌体DNA的动物血液中，M13 DNA永远不能被斑点杂交或PCR检测到。在已经喂养了50 μg M13 DNA的动物中，197bp的M13 DNA片段(M13引物对P5/P6，见图2)可以在喂食后的2、4小时从全血DNA扩增(图4)。在DNA分离，收到了TE的动物，而不是M13 DNA,M13 DNA不可检测(图4)。在没有任何模板DNA扩增反应也为阴性(图4)。在实验中没有显示,M13 DNA片段的472bp可能放大DNA从全血中提取使用底物P5/P7。

在进一步的实验中，我们通常使用斑点杂交(dot blot)法来演示M13 DNA在动物血液中的存在，这些动物的血液中有50、30或10 μg的M13 DNA。所有的DNA样本都是先用RNase进行分析，并将等量的总DNA(约4 μg)应用于斑点杂交杂交实验中使用的过滤器的每个位置。图5所示结果显示，喂食后2-4小时的小鼠血液(细胞和血清)中有M13 DNA。在一项实验中，M13 DNA在喂食1.5小时(未显示数据)后，在喂食小鼠的血液中3个DNA被发现。M13 DNA在没有M13 DNA喂食(图5)或M13 DNA喂食动物24小时后血液的DNA中无法检测到。在另一项实验中，M13 DNA在喂食(未显示数据)后，在8小时的血液中无法找到。印迹杂交信号消除之前的DNA样本DNase处理(图5)，从血液中提取的M13 DNA也可以通过Southern杂交(未显示数据)来识别。
图5：

通过对M13 DNA进行重建，以M13 DNA每槽1到20 ng的数量进行重组，以估计在喂食小鼠50 μg M13 DNA后，2小时和4小时之间的M13 DNA的含量。图5所示的结果表明，原本可以从1毫升血液中提取的50 μg DNA的一小部分大约0.01%到0.1%。这一估计是一个数量级的近似，因为只有一小部分动物的血液供应可以通过心脏穿刺来恢复。
从目前进行的实验来看，没有证据表明在3-6个月的范围内，动物的性别和年龄的差异影响了任何实验报告的结果(见表1,2)。

表2：

核苷酸序列测定证明M13 DNA可通过PCR从粪便或血液中获得
根据以前用M13 DNA(血液)或4小时(粪便)喂养的动物的粪便或血液对PCR产物的核苷酸序列进行了测定。在反应中使用引物P7(图2C)。在大约400个核苷酸中，序列被发现与其他地方发表的真实的M 13 DNA的核苷酸序列相同(yanisch - perron et al. 1985)。偶尔，在一些序列测定中，观察到一些核苷酸变化。然而，这些是随机分布在基因组上的重复的决定。因此，我们推测这些罕见的变异是由于PCR反应中的不忠。
M13 DNA降解在血液或粪便悬浮液中的时间过程
M13 DNA在37°C血液或粪便悬液降解,M13 DNA的持久性是紧随其后的是点状杂交后反萃取DNA后不同时期的孵化(图6)。在血液中,6小时降解消除所有M13 DNA。8小时后，MI3 DNA在粪便悬浮液中降解，约5%的噬菌体DNA仍可检测。在晚些时候(10小时)，甚至没有痕迹的M13 DNA可能被发现。这些数据与活体动物得到M13 DNA的实验结果是一致的。

讨论
实验的概念背景
最可能吸收外来DNA的器官系统是胃肠道，它经常暴露于吸收营养物质的外来DNA。我们直接测试了这种可能性，通过提供一个现成的、很好的特征的外DNA，即圆形或线性的噬菌体M13 DNA，或者是自由的DNA，或者是应用于食物的小颗粒，给那些在喂食之前从未检测到这些DNA的老鼠。然后，这些粪便被检测到M13 DNA的存在，这些研究被扩展到被实验动物的血液中。我们推测M13 DNA的行为与胃肠道中的许多其他类型的DNA相似，但还没有直接研究这个问题。
主要发现
在表1和2中列出了过去5年在我们实验室进行的所有喂养实验和粪便和血液分析。用最大1692个bp的片段(即M13基因组中约23%的总长度(7250个bp)，在喂食后1到7小时的动物粪便中检测到小鼠口腔内的M13 DNA。M13 DNA的大部分片段在< 200到400bp之间的大小范围内被发现。在粪便和动物血液中，M13 DNA的出现和消失的时间过程反映了M13 DNA在血液或粪便悬液潜伏期的稳定性(图6)。M13 DNA的发现只有零散的形式可以从胃肠道中恢复，不同次粪便排泄M13的DNA，和M13 DNA消化道中细菌认为最终对小鼠胃肠道的可能性是噬菌体M13的探测范围。
观察到从老鼠血液中提取的外源DNA可能具有挑战性的含义。在何种程度上，这种DNA会被不同器官系统的细胞吸收?从肠道中提取的外源DNA是否有助于诱变和肿瘤发生?
用高度敏感的PCR方法获得的结果必须经过严格的评估，以避免意外的、偶然发生的污染和实验DNA的细微痕迹。大量对照实验的阴性结果，从未经处理的动物的粪便或血液中提取的DNA样本，或在喂食后的晚期动物的血液，使我们确信这种污染是可以排除的。这些对照实验产生了一致的否定结果，尽管它们是并行进行的，同时也进行了积极的实验。M13 DNA在粪便中短暂的存活已被另外两种独立的方法Southern和斑点印迹杂交确定。此外，血液DNA的PCR产物通过直接序列测定已经明确地鉴定为MI3 DNA。
定量评价
给老鼠注射的M13 DNA的数量在10到50μg之间。这些值必须与小鼠的体重(10到20克)有关，从而构成体重1/106的近似分数。对于平均体重在50到80公斤之间的人来说，他们不得不假设每天摄取大约50到80毫克的DNA与小鼠实验中模拟的情况相平行。这些假设似乎是合理的，特别是对于从动物或植物起源的细胞中提取的营养物质。
外来(噬菌体M13)的DNA在生物体中有多稳定，它能进入细胞并整合到宿主的基因组中吗?在这方面，仍有许多问题有待调查，这些问题在技术上都不容易控制。我们的数据与一种观念相一致，即一种稳定的外来遗传物质在消化道内持续流动，其中一些可以进入血液循环。目前的发现必须与其他类型的DNA进行复制，这些实验已经开始。
这意味着一种DNA的随机混合，包括基因片段或完整的动物、植物或微生物起源的基因，应该被不断地排泄出来，在经历了进化的复杂性之后，无数的生物在几千年没有出现惊人的复杂性进化了。这一连串的线性DNA片段，即重组高度活跃的DNA片段，在过去的两个十年里，人们可能已经对重组DNA进行的实验的生物学后果感到担忧。

游离DNA和质粒DNA在人类唾液对口腔细菌链球菌戈登DL1改造命运
Fate of Free DNA and Transformation of the Oral Bacterium Streptococcus gordonii DL1 by Plasmid DNA in Human Saliva
介绍：
利用竞争性PCR技术从重组质粒中检测520 bp DNA靶序列的存活情况，pVACMC1和新鲜采集的质粒混合唾液后。暴露于唾液10分钟后5位对象的目标剩余放大范围从40到65%和从6位受试者到25%的60分钟曝光分数。pVACMC1质粒DNA所接触新鲜唾液能够改造自然能力链球菌gordonii DL1红霉素耐药,然而，转化活性迅速下降，半衰期大约50秒。过滤灭菌的唾液和1mg/ml pVACMC1 DNA最终浓度下获得了戈登DL1转化。过滤消毒的唾液除了代替热灭活的马血清，S.戈登DL1细胞的诱导能力，虽然效率略低。这些结果表明，DNA从细菌或食物在口有自然的改造主要口腔细菌的潜力。然而，需要进一步的研究来确定是否口腔细菌的转化可以发生在体内。
最近，人们对胃肠道基因转移的兴趣受到了刺激，因为他们需要评估与基因改造的微生物或含有dna的转基因生物转化成肠道细菌可能的基因转移相关的风险。更普遍地说，基因转移在肠道细菌的进化和适应环境挑战方面起着重要的作用。它已被广泛接受，包括质粒接合转移，接合转座子以及噬菌体转导，在肠道细菌间的基因转移中起着重要作用。重组质粒的结合在大肠埃希氏菌的菌株间和在无菌小鼠消化道中引入的乳酸菌之间进行了分体。相比之下,转换的作用可能很少受到关注，很大程度上是因为自由DNA被认为是不可能生存在肠道核酸酶的作用下。尽管如此，最近有报道称，噬菌体M13 DNA的碎片通过小鼠胃肠道存活下来，甚至在一些小鼠组织中也被发现。许多细菌，包括口腔和肠道菌群的代表，都被认为是可以改变的。玻璃体中有能力的细胞对DNA的吸收速度很快，在肺炎链球菌的发生率为100个核苷酸/s;因此，游离DNA需要在短时间内存活，才能使有能力的细菌得以转化。此外，我们对胃肠道中食物的成分或肠道微环境对DNA存活的影响知之甚少。土壤中的游离DNA经常与土壤矿物质和植物多糖结合在一起，在那里它更具有抵抗性的核溶解性攻击，同时仍可用于形成有能力的细菌。
在评估消化道游离DNA的命运时，重要的是要考虑所有区域，包括口腔和食道。口腔细菌之间的第一次接触是传入的和游离DNA在食品和居民微生物区系,是一种最复杂和异质的人体微生物栖息地。某些口腔细菌是牙周疾病，龋齿,和一些系统性感染的重要原因，有些物种也自然主管。在本研究中，我们研究了人类唾液中游离DNA的存活，并利用竞争性的PCR来量化DNA降解。离体的质粒DNA暴露在人类唾液降解时能够改造自然能力的口腔链球菌戈登DL1。
结果
通过竞争PCR和s.gordoniiDL1的转化，监测人类唾液中质粒DNA序列的存活。通过琼脂糖凝胶电泳技术，将人唾液中DNA的存活率提高到最终浓度3.75 mg/ml。这种DNA的共渗可以通过L.lactisIL1403染色体DNA、质粒DNA(pVACMC1和pil253)和线性噬菌体DNA对降解进行视觉评估。在所有的病例中，除了人类唾液外，DNA在未完全降解的状态下可见至少3.5分钟，而唾液酸(pH值3到4)(未显示数据)最多可达1分钟。与此相反，DNA添加到酸性唾液(pH值2或以下)，胰腺乙酰化，或人粪浆在30秒后无法检测到(数据未显示)
为了对特定重组质粒中存在的存活DNA序列进行更敏感的检测，PCR在唾液样本暴露后，将质粒pVACMC1的520 bp段扩增。pVACMC1由大肠杆菌/革兰氏阳性梭形载体pVA838组成，从瘤胃厌氧菌r . flavefaciens中携带有acloned细胞酶编码片段。这两种PCR引物的设计是为了给予高度特异性的检测，因为一个识别向量序列和另一个序列在克隆的纤维素酶片段中(图1A)。从图2可以看出，在唾液中有9分钟的潜伏期后，pVACMC1的520 bp片段仍然可以扩增，而且即使在24小时的潜伏期(未显示数据)之后，可放大的目标DNA仍然可以检测到。
图1：

图2：9分钟后人体唾液中pVACMC1的DNA片段520bp仍能保持不变

通过竞争性的PCR方法对唾液降解的pVACMC1进行了定量检测。建立了一种具有竞争力的质粒(图1A)，并应用于材料和方法。典型的竞争性PCR凝胶如图1B所示。在pVACMC1的培养过程中，5个不同的志愿者(表2)在pVACMC1的孵育过程中，对520 bp片段的存活进行了研究。在10分钟的唾液中，35-61%的目标DNA被降解，而在1小时后75-94%的目标DNA被降解。
表2：不同时间下唾液DNA降解速度百分比表

（解读：可以看到在10分钟时，唾液中仍能检测出50-70%的DNA）
在图3所示的实验中，pVACMC1暴露于人的唾液中不同的时间间隔后，立即提取出质粒DNA以抑制进一步的降解。一半部分退化的DNA以0.8%(wt/vol)琼脂糖凝胶(图3A)为基础，另一半则被用于转化S.gordonii DL1(图3B)的细胞。
图3：

这个实验的目的是要确定一个足够大的DNA片段足以影响转化，并且非常高的初始浓度的DNA(30 mg/ml)被用来允许敏感的检测。pVACMC1的降解明显来自于等离子体的开放圆形形式的消失，在时间为0时可见，从最初的增加和代表4分钟和10分钟之间的线性表的带质粒随后降低强度(图3A)。唾液分泌的pVACMC1 DNA呈快速下降的能力，改变了s.gordonii DL1(半衰期，约50 s)的红霉素抗性，在2分钟降解后的转化率比未曝光的DNA低了10倍(图3B)。通过PCR扩增对特定CMCP2和pVACrev引物和酶活性的生产，通过演示了预期尺寸和限制轮廓质粒的存在，使其真实性得到了验证。转化效率在9分钟时>1X10(7次方)，高于红霉素耐药率的自发突变率(<1X10(8次方)(未显示数据)。成功的革兰氏阳性细菌需要从不同部分降解分子中重新构造一个功能型质粒，这将需要大量的片段，比研究的520 bp PCR靶点要大得多，因为自复制功能，内切葡聚糖酶基因，以及选择标记也必须存在。
在人类唾液通过质粒DNA转化S.gordonii DL1
链球菌是口咽粘膜植物区系的正常组成部分，也存在于各种牙菌斑和龋齿;其中一些物种，包括S.gordonii和S.mutans，据说是天生胜任的。S.gordonii DL1(乳酸链球菌)是一种天然的可转化的菌株，最初从人的血清中分离出来，可通过pVACMC1的体外转化，作为测试受体。
图4：不同情况下S.gordonii DL中pVACMC1变化

在最终浓度为1.0 μg/ml的情况下，可以同时将S.gordonii DL1细胞和质粒DNA同时添加到过滤过的唾液中，如图4所示。从第二志愿者的唾液中(未显示结果)也得到类似的结果。由于在含有红霉素的介质上建立了足够的质粒拷贝数和基因表达水平来实现生长，因此出现了明显延迟。在没有唾液(图4)的情况下，还存在一种滞后相。整个唾液对红霉素耐药的菌落背景(大约106 CFU/ml从总菌落数108CFU/ml)，而在整个唾液中存在的原生细菌预计将与增加的DNA的测试菌株进行竞争。然而，约0.1%的红霉素抗性菌落在琼脂板测试中表现出类似于整个唾液的类似转变。这些含有扩增的pVACMC1质粒DNA，一定是通过转染产生的。在无菌唾液中pVACMC1的降解，通过竞争性的PCR，以接近60%的速率发生在整个唾液中。
在迄今为止的所有实验报告中，S.gordonii DL1根据标准程序通过添加10%(vol/vol)热灭活马血清来达到生长培养基。在图5所示的实验中，研究了替代生长培养基对热灭马血清的能力发展及后续转化效率的影响。采用未经处理的马血清替代热灭马血清，可降低转染率，用热失活和未经处理的人血清(未显示数据)获得类似结果。然而,添加过滤灭菌人类唾液后发展和转换效率仅相当于热灭活马血清的转化率的20%(图5)。在缺乏明显的能力发展诱导因子的情况下，在补充水的情况下，转化效率比热灭活马血清低三倍。

讨论
这项研究表明，游离DNA在人类唾液样本中可以存活很长一段时间，因为在pVACMC1质粒中有40-65%的520 bp目标区域，在10分钟的唾液潜伏期后被放大。由于实验是在体外完成的，涉及一个4:1混合唾液和加入的DNA溶液，因此，降解的动力学并不能准确地再现体内发生的反应。然而，在较短的时间间隔内，对含dna样本的新鲜唾液的混合物必须被认为是一种合理的模拟摄入食物与口腔唾液的混合物。在这里研究了初始高浓度的DNA，以测试质粒被暴露于唾液腺核酸酶的的能力，从而改变了S.gordonii DL1的天然细胞，一个物种的口腔菌群的组成部分。随着唾液时间的延长，转化活性的迅速下降，其半衰期约为50秒，反映了转化DNA分子的数量减少。革兰氏阳性菌的自然转化被认为涉及一种活性质粒的重组，从多个部分降解的质粒DNA分子在细胞中表现出两热的动力学。因此，转换频率预计将会随着DNA浓度的平方而变化。
我们也在这里展示了自然的能力，S.gordonii DL1可以在人类唾液的存在中被质粒DNA改变。目前还不知道口腔链球菌在口腔内的条件下有多大的发育能力，我们并没有试图直接在此解决这个问题。然而，我们的研究结果确实表明，热灭活马血清并不是能力发展的绝对要求，它常被添加到S.gordonii DL1细胞中，以促进“自然”能力的发展。此外，我们的数据表明，人类唾液本身可能包含促进能力发展的因素。因此，没有理由认为，S.gordonii和可能的其他口腔链球菌，如S.mutans，在实验室条件下显示出自然的转化能力在体内的口腔内不能进行低频率的转化。在这里报告的转化实验是在高细胞密度和高初始DNA浓度(1.0 mg/ml)中进行的，目的是为了最大限度地检测到变化的数字，而我们在这里并没有尝试去估计这些事件在体内的频率。1 mg/ ml的质粒浓度大约相当于109个细胞/ ml的细菌培养1 ml的完整质粒含量，假设10 kb质粒的细胞拷贝数为50，不可能自然发生。假设两次碰撞动力学，据预测,转换频率会降低了106倍的质粒浓度1 ng / ml比那些报道为1mg/ml质粒浓度,但它是从均匀的纯培养条件下往体内推非常困难,特别是对于菌落或生物膜细胞和DNA可能高度本地化。定量的问题是否重要的自然遗传转化体内发生口腔因此依然开放,需要进一步的调查,尽管它应该清楚,即使是非常罕见的事件可以非常重要如果转换DNA给予接受者的选择优势。在肠道的不同区域，DNA会不断地从被摄入的植物、动物或微生物细胞中释放出来。尽管在消化道下由于胃酸和胰腺核酸的影响，裸DNA的存活几率较小，但噬菌体M13的存活在大鼠肠道中已经得到证实。综上所述，在各种肠道微环境中发生微生物转化事件的可能性是不可能被排除的，并值得注意，这是肠道微生物适应和进化的一个潜在因素。

小鼠摄入异质的DNA(M13)通过肠壁黏膜进入小鼠的外周血白细胞、脾脏和肝脏，可以共价连接到小鼠DNA
Foreign (M13) DNA ingested by mice reaches peripheral leukocytes, spleen, and liver via the intestinal wall mucosa and can be covalently linked to mouse DNA
摘要：
食物摄取的外源DNA在小鼠胃肠道中并没有完全降解。噬菌体M13mp18 DNA作为一种缺乏同源性的测试分子，将其用于小鼠DNA上，用吸管喂养或添加到小鼠的食物供应中。这种外来DNA在动物体内的命运被多种方法所遵循。在84种动物中，在小肠、盲肠(在18小时后)、大肠或粪便中检测到M13mp18 DNA片段。在254只动物中，高达976 bp的M13mp18的DNA片段在喂食后2-8小时被发现。在对照组动物中，不能检测到M13mp18的DNA。M13mp18 DNA片段通过PCR在外周血白细胞中被追踪，通过荧光原位杂交技术在1-1000白细胞2到8小时之间，喂养后在脾脏或肝细胞24小时，但不迟于。M13mp18 DNA可以在柱状上皮细胞中荧光原位杂交追踪，在派伊尔氏淋巴集结的盲肠壁的白细胞，在肝细胞中，在B细胞，T细胞，和脾脏巨噬细胞中。这些发现表明，通过肠壁和派伊尔的斑块将外来的DNA传输到外周血白细胞，并进入几个器官。在扩大喂养后，M13mp18 DNA可以从总脾脏DNA重新克隆到l载体。在约2.5X10(7次方) 个斑块中，一个斑块被分离出来，其中包含一个1299个核苷酸对片段(nt 4736 - 6034)，该片段被鉴定为M13mp18 DNA。该片段与80个nt DNA段共价连接，与小鼠IgE受体基因70%同源。来自另一个空斑的DNA也含有小鼠DNA、细菌DNA和重组l DNA。另外两个斑块包含M13mp18 DNA片段至少641(nt 2660 - 3300)或794(nt 4640 - 5433)核苷酸对。这些观察的医学和进化影响可能是相当大。
在哺乳动物消化道(GI)的日常食物供应中摄取的外来DNA的摄取和命运几乎没有被调查过。胃肠道的上皮细胞衬里为与外源DNA和DNA-蛋白复合体提供了一个巨大的接触表面。我们已经证明，每顿饭后，这个表面会暴露在不同来源的DNA片段中。在小鼠中，大约1-2%的口服噬菌体M13mp18 DNA在进食后，在1到7小时之间持续存在肠道和粪便中。这些碎片的大小范围从100 bp到400 bp，有些扩展到1700 bp。一个很小的比例（≤ 0.1%）在口服M13mp18 DNA后的2和8小时之间，在动物的血液中被检测到。
结果与讨论
在不同的器官系统中，食物摄取外源DNA的数量。
口服给药的M13mp18 DNA片段的被回收在粪便(37只动物)、肠道的不同部分(42只动物)、血液(254只动物)、脾脏和肝脏(42只动物)中。经过胃通道后，95%的M13mp18 DNA都丢失了。M13mp18 DNA片段大小在100到1700 bp之间，被从粪便或不同肠段的内容物中恢复。在M13mp18 DNA喂养的254只动物的血液中，PCR确定了194-976 bp之间的M13mp18 DNA片段。从TE缓冲液喂养对照组动物的器官中，M13mp18序列从未被隔离。通过与重建实验的结果进行对比，确定口服M13mp18 DNA后：小肠含2.2-0.7%(喂饲后1-8小时)，盲肠2.4-1.1%(2-18小时)，大肠0.2-1.7%(2-8小时)，血液约0.04-0.08%(2.3-8小时)(图1)。
图1：M13mp18 DNA片段在小鼠各部位测出图

血液从心脏经缓冲穿刺中获得，或分别在模拟喂食或喂食小鼠M13mp18 DNA后的2-8小时后获得。血细胞通过离心新鲜血Ficoll梯度分离。外周白细胞的比例包含粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的混合物，经Giemsa染色(未显示数据)。通过标准协议，从白细胞中提取DNA，并通过PCR检测M13mp18 DNA片段存在，使用人工合成的寡核苷酸引物(地图位置在M13mp18 DNA上，图2C)。M13mp18 DNA喂养25只动物4小时后的PCR分析和Southern印迹转移结果见图2A，在白细胞中发现了真正的M13mp18 DNA。从血浆、红细胞或洗漱液中提取的DNA，或从5个受缓冲对照动物的白细胞中提取的DNA，并没有产生M13mp18特定的DNA特异性信号。喂食后18小时，用磁珠法分离脾脏的白细胞。PCR和杂交分析结果显示，M13mp18 DNA来自于细胞毒性T细胞、B细胞和巨噬细胞的DNA(图2A)。
图2：PCR检测在小鼠外周血白细胞、肝及脾脏细胞中的M13 mp18的DNA片段。

(解读：黑点就是m13的DNA片段)
我们得出的结论是，少量M13mp18 DNA口服摄入2-8小时后的老鼠可以恢复最大712 bp的碎片，从细胞质和细胞核的外周白细胞和喂养18小时后的脾脏细胞毒性T细胞,B细胞,巨噬细胞(图2A)。因此，外周血和脾外的外源DNA主要存在于白细胞中，可能是因为它们的防御功能。携带外源DNA的白细胞可能从肠壁的淋巴结转移到血液和脾脏。
FISH，通过使用FISH技术，M13mp18 DNA可以在进食后2到8小时之间的1000个外围白细胞中可视化(图3A)。在饲喂后的12~18小时，在培养后的48小时内，对脾脏细胞进行了染色体壁球的制备(图3B)。M13mp18 DNA特异性信号在细胞或中期染色体的一小群中被激发，尽管通常只在一个染色单体上(图3B)。在由TE缓冲喂食动物制备的细胞中，这些信号从未在白细胞核或脾脏细胞的染色体中获得(图3C)。这些数据证实了PCR对分离白细胞DNA的影响(图2A)。M13mp18序列在脾脏和肝细胞中被PCR(图2B)喂养后，至少持续到18小时。在微量的，摄入食物的外源DNA片段会穿越肠道–血屏障，在进食后，大约0.1%的周围白细胞会达到8小时。外来DNA在喂食后持续在脾脏和肝脏中持续18小时。
图3：

通过肠壁黏膜吸收外来DNA。
我们追踪外源DNA通过肠壁的途径，小鼠喂食M13mp18 DNA 3–8小时前用FISH法对盲肠切片。M13mp18 DNA特异性信号可以在盲肠的柱状上皮核(图4 E-I)和肠壁的淋巴结(图4b)的白细胞中识别。同样的白细胞在脾脏喂食后3-12小时(图3b)，肝脏(图4d)在喂食后3-8小时分析。含有M13mp18 DNA肝细胞经常靠近血管。从TE喂养老鼠(图4c)的对照是阴性的。从12种不同M13mp18 DNA喂养动物的总数中，有40到60个的盲肠、肝脏或脾脏切片，并以类似的结果调查了5个TE喂养的控制。数据显示，外源DNA被肠壁上皮细胞吸收，在肠壁淋巴结集中到达白细胞，然后通过外周血白细胞进入机体。外源DNA在脾脏和肝脏中被发现时已达18小时。
图4：

M13mp18 DNA片段可以从喂养这种噬菌体DNA的小鼠脾脏DNA中再克隆。
我们不得不应对微量外源DNA的检测。因此有必要从小鼠的器官DNA中再克隆出M13mp18 DNA来评估结果的有效性，并确定宿主细胞中外源DNA的状态。如材料和方法所述，采用了三个喂养计划。结果如下:(i)在M13mp18 DNA单次喂养50 μg后，108 ldashii克隆筛选没有M13mp18的DNA。(ii)之后，在每天的时间间隔连续三次喂食后,一个重组克隆的分离在10(8次方)之间(图5,克隆a)。(3)1周中每天喂食产生三个重组克隆在2.5 x 10(7次方)(图5,克隆b和c)。这些实验是在大学的不同建筑中进行，将测试M13mp18 DNA时因疏忽而污染的可能性降到最低。
图5：从喂食DNA的小鼠脾脏中克隆出的外源M13mp18 DNA

（解读：可以看到噬菌体M13mp18的基因组序列共长7250bp，从小鼠的脾脏出克隆出的三段含有M13mp18的DNA片段，分别位于噬菌体序列的不同位置，证明小鼠脾脏吸收和融入了外来的DNA片段进了小鼠自身的DNA中。）
重组DNA准备(从喂养计划2和3)中M13mp18 DNA通过使用适当的寡核苷酸引物和应用的生物系统A373 DNA测序仪重新测序。在重组克隆中存在的M13mp18 DNA片段，之前已经通过将[32P]标记的重组DNA杂交到一种混合了真正的M13mp18 DNA片段的混合物中，这些DNA片段是由MspI,RsaI，或SspI和Southern生成的。克隆a是通过方案2分离出来的，包含了M13mp18 DNA的核苷酸4640-5433(794 bp)片段。在图5a中显示了侧翼核苷酸序列，并在GenBank搜索中进行了比对识别。确定了与M13mp18的核苷酸4640相邻的核苷酸序列。它代表了一个未知的序列，没有出现在任何一个基因库搜索(12月1996)，而且可能是老鼠的起源。喂食计划3导致3个M13mp18 DNA 阳性克隆被隔离。他们的32p标记DNA杂交到M13mp18 DNA和小鼠基因组DNA(图5，克隆b和c). M13mp18 DNA片段在三个阳性克隆中的两个被分配给核苷酸2660-3300(图5，克隆b)和4736-6034(图5，克隆C)。三个分析的克隆包含不同的M13mp18 DNA片段，它没有包含用于克隆的BamHI酶切位点。这一事实进一步证明了污染的情况。克隆C，80 bp的DNA与小鼠IgE受体基因同源性70%，附近发现4736 M13mp18 DNA的核苷酸,通过一个来历不明的GATATAT序列链接(图5,克隆C)。这些重组克隆的支持结论：真实M13mp18 DNA由于喂养可以检索从小鼠脾脏DNA克隆出来(图5A-C),可以共价链接到老鼠的DNA(图5，克隆C)
M13mp18基因在小鼠组织中的最大寿命。
老鼠喂养50μg的M13mp18 DNA后，这种外来DNA可以用斑点杂交法检测到(盲肠)或PCR方法(所有其他器官)高达18小时在盲肠的内容物检测到(图1B)，在外周白细胞DNA是8小时，在脾脏和肝脏的DNA是24小时(数据没有显示)。单次喂养DNA后，从血液、脾脏和肝脏中在42 小时、68小时和1周后提取，没有发现M13mp18 DNA。
结论。
该项目的设计源于外源（腺病毒）DNA整合到已建立的哺乳动物基因组中的甲基化研究。综合外源DNA的甲基化被认为是对外源基因活性的一种古老的细胞防御机制。在不断摄入外来DNA的过程中，人们一直在寻求这种防御机制，因为外来DNA最可能进入有机体的是它的胃肠道。肠壁上皮细胞摄取外源DNA的机制尚不清楚;它可能类似于由细胞培养与外来DNA结合。肠道集合淋巴结细胞，膜上皮细胞，是一种主要途径，通过这种途径，致病微生物如沙门氏菌、霍乱弧菌或志贺氏杆菌可以穿透肠道上皮屏障。研究M细胞是否也是与在胃肠道中抵抗消化的大分子的相互作用的目标，将会很有趣。显然，肠道并不是阻止大分子或甚至微生物摄取的绝对屏障。
口头给药的M13mp18 DNA可以从脾脏DNA重组到DNA，与小鼠IgE受体基因70%同源(图5,克隆C)。至少在一个案例中,从脾脏重新克隆的DNA也含有可能通过肠壁通过类似于M13mp18试验DNA的途径即经从肠道内运输的细菌DNA(图5,克隆)。因此，血液或脾脏白细胞可以作为许多有规律地穿透肠粘膜的外源DNA的储存库。在脾脏中，食物摄取的外源DNA与小鼠DNA之间的联系引起了对一般进化结果的猜测，以及在诱变和致癌方面的医学相关影响。

从含转基因成分的饮食向大鼠组织水平基因转移问题
Addressing the issue of horizontal gene transfer from a diet containing genetically modified components into rat tissues
摘要：
转基因(GM)粮食作物被认为具有提供粮食安全的潜力，特别是在发展中国家。科学家们对转基因生物(转基因生物)的摄入带来的危害表示担忧。其中一个有很大争议的危险，是从转基因食品或饲料到人类或动物组织的可能水平基因转移。有许多对转基因作物喂养的动物组织中一些转基因序列的存在的研究。在转基因作物中，许多插入的基因都在花椰菜花叶病毒(CaMVP35S)的启动子的控制之下，并产生杀虫蛋白。建议附加该启动子的摄取对健康的危害。CaMVP35S可以在很宽的范围内对生物体起作用（植物和动物）。也证明了CaMV-P35S启动子序列能将邻近的组织-特异性基因启动子转化为全局活跃启动子。目前的研究是为了评估从花椰菜花叶病毒-35s启动子(CaMV-P35S)到不同器官的细胞的水平基因转移的可能性，这些老鼠在含有转基因成分的饮食中吃了3个月。分析结果显示:1)摄入CaMV-P35S启动子DNA片段融入血液,肝脏和实验老鼠的大脑组织,2)通过增加饲喂时间，可显著提高转基因目标序列的转移3)吃下的转基因饲料中的不同转基因片段，被纳入到老鼠的不同组织中，从一个目标序列到另一个目标序列。
结果与讨论
实验室食物样本的PCR扩增
本实验使用的实验食物样本，在经过花椰菜花叶病毒启动子(CaMV-P35S)的存在时，给予了阳性结果。在所有使用过的饮食样本中，检测到一组195 bp大小的P35S启动子引物(图1)。对照饮食未发生扩增。
图1：

测序结果分析
如前所述，进一步证实在本研究中所使用的饮食中存在花椰菜花叶病毒-35s(CaMV-P35S)启动子，对p-35s启动子引物扩增所获得的PCR扩增序列进行了内部测序。使用NCBI-BLASTN程序进行序列比对分析。BLASTN序列比对显示有100%的同源性的预期大小扩增片段(195 bp)CaMV-P35S启动子核苷酸(nt)座标7190到7384(图2)，同时也分享100%的序列同源性的二进制向量

PCR扩增不同组织
PCR扩增使用三种引物(GF70,GT88和P-35S)，在30、60或90天之后，分别在小鼠的血液、肝脏和大脑的DNA样本中，分别显示了预期大小s的70、88和195 bp。一些放大的代表在图3、4和5中。然而，这些引物中没有一种是在以非转基因食品喂养的第二组大鼠的DNA样本中被放大的。证实喂转基因饲料的大鼠基因组DNA的转基因DNA的存在,进一步分析内部排序的大量扩增子(195 bp)获得P-35S子引物的扩增的DNA样本在转基因饮食喂养的大鼠肝脏和大脑对GenBank数据库进行。结果表明,这些序列显示与花椰菜花叶病毒全基因组100%相似，在相同的核苷酸坐标7190到7384中，代表195 nt的CaMV-P35S启动子，其与PCR扩增(P-35s)从转基因饲料扩增得到100%的相似。它也与二进制向量的数量相一致，包括那些与本研究中所使用的饮食片段相一致的载体。已知的二元向量被广泛用于基因转移。
图3/4/5(合集)

对转基因的靶序列转移的总频率(GF70,GT88和P-35S)从转基因饲料进入血液、肝脏和脑组织检测到DNA样本已经从33.3%上升到37%，喂养老鼠转基因饲料30或60天,90天后达到了52.8%的最高水平。方差分析的统计分析这项工作的结果表明,喂食老鼠转基因饲料在30、60或90天增加通用目标序列的平均传输显著(8.0±0.0000,12.3±1.2018,16.7±1.4529)分别通过增加喂养时间(图6)。目前的研究结果表明，血液、肝脏和脑组织都有累积效应。
图6：

在我们的调查中，我们评估了CaMV-P35S启动子从转基因饮食到实验动物的转移。为此，我们设计了3个引物，将CaMV-P35S启动子的3个片段增强，从核苷酸坐标7117到7384(表1)，占整个启动子的近80%(343 bp)。在某些情况下，在目前的工作中，这三个部分都在同一种动物中被扩增。这一发现可能会引起担心整个启动子可能已经转移到那些动物的基因组，这其中的风险在于，因为,即使是一个启动子只含有来自于CaMV-P35S的46 bp 5 '序列子，以前足够准确转录起始。
表1：

目前的研究结果表明，由于花椰菜花叶病毒被认为与人类乙型肝炎病毒密切相关(Doolittle et al .，1989,Xiong,Eikbush,1990)，因此，对含有花椰菜花叶病毒35S启动子的饮食的摄入存在健康危害。同时也知道，CaMV-P35S启动子可以直接表达由大肠杆菌中细菌的新霉素磷酸转移酶II(NPTII)基因的表达(Assaad和Signer(1990)所报道的)。他们还报告说，它可以在各种各样的有机体(植物和动物)中发挥作用。也证明了CaMV-P35S启动子序列可以将邻近的组织和特定于器官的基因启动子转化为全局主动启动子(Zheng et al .，2007)。之前，Ho和他的同事(Ho et al .，1999)推断出CaMV-P35S启动子可以结合活跃的休眠病毒，产生新的病毒，并通过表达正常基因引起癌症。
比较三种组织(血液、肝脏和大脑)在这个工作期间(90天)的整体持续检查，并没有观察到在这些组织中转基因DNA转移率的显著差异。转基因DNA转移到血液组织几乎没有(12.66±2.6034)高于转基因-DNA转移到其他组织:肝脏(12.00±3.6055)和大脑(12.00±2.0000)。在马扎等人(2005)进行的一项研究中发现，血液组织是传输频率最高的组织，其次是富含血管的器官，包括肝脏和肾脏的渗透。他们的结论是，血液是吸收短DNA片段的主要组织，因为它收集直接被肠上皮细胞和免疫系统细胞吸收的大分子，而DNA分子可能通过血液循环在机体内运输。
我们的研究结果表明，对大段的吸收频率大于小段的吸收频率。这个结论是基于这一事实的效率转移转基因-DNA段(70 bp)放大GF70引物是最低(1.09±0.4161)比P-35S(3.8±0.8069)和GF88(2.09±0.7318)(图7)。
图7：

在这些动物中，GF70 rimers被扩增，而P-35S引物在动物中没有扩增，因此仅计算了GF70段的传输频率。与P-35S相比，GF70段对大鼠基因组的亲和力显著低于P-35S. 。Palmen和Hellingwef(1997)和Meier和Wachernagel(2003)假设片段越短，吸收效率越低。
我们的结果支持这一建议，即监测转基因流是一种衡量转基因作物可能产生的环境影响的方法，并作为一种有害影响的预警系统(NRC,2002)。