回复：转基因食品的最大问题是慢性剧毒持久毒害人体健康

利用番茄丛矮病毒突变体与宿主基因进行双重重组，恢复野生型病毒
Restoration of Wild-Type Virus by Double Recombination of Tombus virus Mutants with a Host Transgene
在接种野生型病毒时，用番笳丛矮病毒(TBSV)的外壳蛋白基因改变了烟草benthamiana植株，并没有引起有效的病毒抗性。随后，来自13个转基因株系的R1和R2的后代用TBSV突变体接种，含有缺陷的外壳蛋白基因。在未转化植物中，感染了TBSV突变体的植株中出现了轻微症状。然而，在2到4周内，多达20%的转基因植物偶尔开始发展为致命的野生型病毒感染综合症特征。这些植物的RNA杂交和免疫印迹分析，和未转化烟草benthamiana从转基因株系中接种病毒，表明野生病毒是通过有缺陷病毒和外壳蛋白转基因之间的双重重组事件再生的。在TBSV缺失突变体中含有核苷酸序列标记与黄瓜嵌合体坏死病毒(CNV)含有缺陷的TBSV外壳蛋白基因得到了类似的结果。在这两种情况下，纯化的病毒微粒含有野生型TBSV RNA或CNV嵌合RNA，利用转基因外壳蛋白mRNA重组。这些结果表明，重组型的番茄丛矮病毒可以经常出现在病毒基因表达的转基因植株上。
在本研究中，我们研究了转基因的烟草benthamiana植株是否表达了番茄丛矮病毒(TBSV)外壳蛋白RNA，能够抵抗TBSV感染，如果它们能够与TBSV或黄瓜坏死病毒(CNV)的衍生物重组，就无法表达功能性的外壳蛋白。之所以选择外壳蛋白突变体是因为它们可以建立全身性感染，然而，引起的症状相对较轻。轻度突变表型及其转化为致死综合征，从而提供了一个方便的测试，由此我们能够直观地识别可能的重组体。通过对这些植物的分析表明，发现突变体与转基因植物的双重重组有可能使野生型病毒再生，能在受感染的植物中占优势地位。
试验结果
TBSV外壳蛋白转基因不能引起有效的抗病性。
烟草benthamiana植株通过TBSV的外壳蛋白基因转化，以评估对TBSV感染的抗病程度，和选择150r0独立转化植株，以抵抗卡那霉素。自花授粉后种子被收集，种子萌发后用Northern杂交技术对发芽植株的总RNA提取物进行分析，以评估外壳蛋白mRNA表达和积累(数据未显示)。从转基因植物中分离出的基因组DNA的Southern印迹分析表明，单次整合发生在不同的位点上在10条不同品系的基因组中(未显示数据)。Western 印迹(免疫印迹)的分析是为了评估蛋白质的表达水平，但我们无法检测到这些植物中任何一种植物的外壳蛋白，能检测到每毫克植物组织(未显示的数据)不到100 ng的蛋白质。
从72株转基因植物表达外壳蛋白mRNA进行测试的能力抵抗野生型TBSV感染来源于pTBSV-100(赫恩et al.1990)副本(图1)。在这些实验中,R1后代(每株系20株)植物注射1/5,000稀释液(大约1 ng / ml)TBSV感染的sap。大多数受感染的植物产生致命反应,这是区分的未转化烟草benthamiana植株如图2A所示。这种反应的特点是出现了一种轻微的嵌合体，在接种后3天的后出现淡黄色斑点(dpi)，随后发展为局部坏死性病变。1周后出现顶部坏死和脉管破裂，这些植物通常死于9 dpi。然而，来自13个独立株系的植物(表1，显示其中的6条)，在使用稀释物接种后，在接种后1至2周出现症状 (wpi周) ，但是，在2到4个wpi中，其余的植物也逐渐坏死并死亡。在同一株系的植物中，在接种高浓度的TBSV病毒粒子(数据未显示)后，更极端的感染发生在接种后，只有不到20%的植物存活超过10 dpi，所有的植物都在2到4个wpi之间死亡。在病毒浓度最高时(1 mg/ ml)中，接种的植物迅速发展坏死综合征，2个wpi死亡。此外，转基因植物接种TBSV进行体外转录时也导致了TBSV症状的迅速出现，并导致植株死亡(数据未显示)。这些结果表明，这些特殊的转基因植物的株系，无论是对野生型病毒或RNA感染不能产生有效的外壳蛋白介导的抗性

一种TBSV外壳蛋白缺失突变体和外壳蛋白转基因mRNA重组产生野生型病毒。
确定抗性是否表达了反对TBSV衍生物比野生型TBSV引起症状轻微,植物接种T -∆cp RNA(图1),在外壳蛋白基因中有少量缺失和未处理致命性疾病综合症(图2 b;和Scholthof 1993)。这个突变体有46个核苷酸(nt)缺失，产生一个下游移码和过早终止九个密码子。外壳蛋白缺失涉及编码区域的大部分带正电荷的R域，被认为与病毒体中的RNA相互作用。由缺失突变引起的全身性症状比野生型病毒感染致命综合症严重程度低。这些症状包括轻度嵌合体和叶片扭曲，局部坏死和发育不良(图2C)。然而,T - ∆cp在2 wpi,一些R1和R2的植物转基因后代开始表现出脉管崩溃和死亡(图2 d)。有趣的是，在接下来的2周的观察中，植物开始死亡的时间是相当多变的。
图2

最终,12 - 20%的植物在六个最广泛的测试株系表现出致死综合症(表2),形成鲜明对比,所有的未转化的对照植物接种T -∆cp RNA通过开花保持着轻微的系统性表型。

来自六个株系的植物叶组织接种T∆CP RNA后对病毒微粒的存在进行了测试,显示迟发性致死反应。其他几个T -∆cp-感染植物来自相同或不同的株系,只有轻微的表型被用作对照。琼脂糖凝胶分离后,病毒微粒可以通过免疫印迹分析检测到(图3)。病毒微粒恢复来自于未转化的对照植株感染野生型TBSV(图3,车道6),和来自转基因植物接种T -∆cp后发展成致死综合症(图3,车道14)。未受感染的植物提取物没有明显的病毒微粒(图3,车道1),来自未转化植物感染T -∆cp(图3,车道2),或来自转基因植物接种T -∆cp后表达轻微表型(图3,车道10)。

转基因植物接种T -∆cp后积累的病毒微粒，可能是由于在转基因植株中突变体和外壳蛋白表达的互补,或转基因mRNA和外壳蛋白缺陷突变株的重组。为了区分这两种选择，从生长坏死综合症植物中分离出纯化的病毒微粒，用于接种未转化的烟草benthamiana植株。我们预计从突变RNA的转录作用感染会产生轻微的表型，不会产生病毒微粒。相比之下,从T -∆cp和外壳蛋白mRNA转基因之间重组产生的重组病毒，会导致植物伴随大量病毒微粒的积累而死亡。每一种未转化的烟草benthamiana植株感染了从转基因植物中纯化的病毒微粒，发生致命反应后产生野生型病毒症状，并且可以从这些植物中提纯病毒微粒。(数据没有显示)。研究结果表明，在外壳蛋白转基因与缺陷病毒之间的重组事件生成功能型病毒。
在另一系列的实验中,我们未转化的植物共接种T - ∆cp每毫升120µG 和野生型TBSV浓度从每毫升200ng到120µg。在所有情况下,植物产生了野生型致死综合症,并含有病毒微粒(数据没未显示)。这些结果表明,野生型病毒比T -∆cp突变体能够更有效地竞争全身活动,他们认为假定的重组,出现在主要受感染的植物的T -∆cp迅速感染。
一个TBSV 外壳蛋白突变体含有标记与一个CNV嵌合蛋白缺失突变体与植物转基因的重组
为了验证这种重组，而不是与野生型病毒的污染，我们进行了几个对照实验。设计了两种标记结构来具体识别重组后代。第一个是TBSV外壳蛋白缺失突变体,TSpe∆cp,包含一个SpeI酶切位点,位于外壳蛋白编码区的上游(图1)。我们还构建一个相关的番茄丛矮病毒嵌合体,指定Ch -∆cp(图1),我们用TBSV外壳蛋白缺陷基因替换了CNV外壳蛋白,与出现在T -∆cp的相同。Ch -∆cp还包含SpeI酶切位点作为一个标记。
作为第一步，我们想要确认由标记结构引起的表型。当来自TSpe -∆cp和Ch -∆cp突变体的RNAs被用来接种未转化植物,只观察到轻微的表型(图2 b)。相比之下，等效的野生型病毒(TSpe,Ch,CNV;图1)引起严重的致死性表型(图2A)。从这些植物免疫印迹分析表明,只有当野生型结构被用作接种物时病毒微粒才存在(图3,车道7,8,9),但不存在于未转化植物感染TSpe -∆cp和Ch -∆cp突变体(图3,车道4和5)。
当来自TSpe -∆cp和Ch -∆cp的RNAs被用来接种转基因植物,大多数植物造成的轻微症状类似TBSV缺失突变体与未转化植物(图2 c)。然而,平均从一个株系14%的植物感染TSpe-∆cp,和六个株系的16%植物被外壳蛋白缺失嵌合体侵染,Ch -∆cp(表2),开发了野生型,TBSV-像致命的症状(图2 d)。这些结果表明,TSpe -∆cp和Ch -∆cp还可以与转基因进行重组。在琼脂糖凝胶中分离病毒后的额外的血清学分析显示，转基因植物中表现出致命症状的病毒颗粒的存在(图3，车道16和17条)，但在存活的转基因植物中却没有(图3，第12和13条)。
为了更详细地分析转基因植物中致死性坏死的病毒RNA，我们进行了Northern杂交和序列实验。为Northern印迹分析,总RNA分离自未转化植物接种T -∆cp,TSpe-∆cp和Ch -∆cp作为对照,或未转化植物接种野生型衍生物TBSV, TSpe和Ch。RNA也同样分离自转基因植物感染外壳蛋白缺失突变体后(T -∆cp,TSpe-∆cp和Ch -∆cp)轻微和严重表型。杂交探针,我们使用了寡核苷酸cpNB(5′CCCTGCAAGGCTGTGGCCC 3′),该序列在用于感染的突变体中不存在T -∆cp,TSpe-∆cp和Ch -∆cp。图4所示的结果表明,RNA从健康组织中分离(图4,车道1)或未转化植物感染T -∆cp,TSpe-∆cp,Ch -∆cp后,未能与cpNB寡核苷酸杂交后产生一个信号(图4,车道2,4,5,分别)。相反，RNA来自于未转化植物感染了这些突变体的野生型版本(无外壳蛋白缺失)TBSV、TSpe和Ch，与寡核苷酸杂交(图4，分别为6、7和8车道)。然而，野生型CNV与cpNB寡核苷酸(图4,车道9)中表现出较弱的杂交，我们认为这是不匹配的杂交，因为CNV只包含了cpNB序列中19个nt中的10个。只有RNA来自于转基因植物的感染了T -∆cp,TSpe-∆cp和Ch -∆cp发展致死综合症后与cpNB寡核苷酸有很强的杂交信号(图4,车道15,17,18分别),而从表达轻微症状的转基因植株中提取的RNA中没有发现信号(图4,车道11、12和14,分别)。这些结果表明，转基因植株发生致死综合征的含有重组的缺失序列已恢复。

序列分析验证双重重组事件。
分析假定的重组RNA来自转基因植物感染T -∆cp,TSpe-∆cp和Ch -∆cp转录后发展严重的表型、病毒微粒被纯化和RNA从病毒微粒恢复。然后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增外壳蛋白基因和周围的寡核苷酸序列(见材料和方法)，具体用于每一个假定重组。寡核苷酸引物5′cp-3′cp或TF-Tr被用来扩增T -∆cp,TSpe-∆cp和Ch -∆cp基因序列(图.5A和B)。我们应该强调的是引物用于扩增Ch -∆cp包括一个TBSV特异性引物和第二个CNV侧翼序列特定引物。引物CF-3′cp或5′cp-Cr(图5 a)允许扩增嵌合CNV病毒，并没有扩增TBSV重组体(图5B)。扩增5′cp寡核苷酸产物的序列分析(获得序列上游、下游和缺失的序列),和cpNB寡核苷酸(外壳蛋白基因的上游序列)验证了在TSpe -∆cp和Ch -∆cp克隆中SpeI位点标记的存在。在这些病例中，从6株植物中克隆出18个完整的外壳蛋白基因(每株3个克隆;每株系一个或两个植物)来自四个独立的株系感染T -∆cp,9个克隆来自三株植株代表三种株系感染Ch-∆cp和9个克隆来自三单个株系三株植物感染TSpe-∆cp。这些结果表明，双同源重组事件重新生成了野生型外壳蛋白基因。然而,从植物感染T -∆cp和TSpe-∆cp恢复的两个额外的测序克隆含有代偿性鸟嘌呤残基插入，在原始46-nt缺失后恢复外壳蛋白开放阅读框。这些衍生品将在随后研究中进一步分析。
区域的同源性和长度程度影响重组体的恢复。
为了确定重组体的恢复可能与转基因和缺陷病毒之间共享序列的比例相关，转基因植物从构造T-CAT转录接种(图1)。这种衍生物含有氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因，克隆在TBSV外壳蛋白基因的5′端,所以这655 nt,或56%的外壳蛋白基因缺失。当T-CAT转录用于接种未转化的植物时,所有的植物都表现轻微的表型(图2 b),与转基因植物的具有严重表型比例相比(图2 d)减少到约4%,相比植物接种∆cp衍生物的14 - 16%(表2),再次，病毒凝胶免疫分析显示未转化植物或转基因植物感染T-CAT表现轻微表型，缺乏病毒微粒(图3,车道3和11)。相反，转基因植物表现致命表型，包含病毒微粒(图3，第15巷)。Northern杂交分析也显示，轻微表型的未转化或转基因的植株与cpNB寡核苷酸杂交失败(图4、车道3和12)，而转基因植物表现出严重表型杂交到cpNB寡核苷酸(图4，车道16)。对外壳蛋白-CAT联结点的测序也表明，双重重组修复了缺失的外壳蛋白序列(未显示数据)。
确定转基因和缺陷病毒之间的同源区域对重组很重要,也用CNV外壳蛋白缺失突变体进行实验,C -∆cp,包含一个53-nt缺失来自3388到3441位置。这个区域包括外壳蛋白基因的中枢区域和缺失产生的下游移码和序列缺失后的早期终止密码子(图1)。在这种情况下,160株进行了测试,但重组可能导致非同源重组恢复，免疫印迹分析后没有恢复。此外,C -∆cp产生非常严重的症状,这就给表型筛选带来了困难，因此突变株的致死效应也限制了可能的非同源重组体出现的时间长度

讨论
续上
TBSV与宿主基因重组是一个常见事件。从这些实验中最重要的发现是，通过在植物中表达的外壳蛋白mRNA转基因的双重重组事件恢复野生型病毒，病毒外壳蛋白基因突变与一个可重复的现象，可以很容易地检测到的缺陷。我们初步观察了野生型病毒的再生，并在实验中获得了对转基因烟草benthamiana植物抗性的评价。然而，这些植物中没有一个具有明显的外壳蛋白介导的对许多其他病毒所描述的类型的保护(Baulcombe 1996; Beachy 1993; Lomonossoff 1995; Scholt-hof et al. 1993b; Wilson 1993)，所有的植物在4个wpi内死亡。另一个主要区别是，在转基因植物中存在着CymRSV外壳蛋白，而我们在实验中无法检测到涂层蛋白的积累。
规避野生型TBSV感染相关的快速死亡,我们接种植物TBSV外壳蛋白突变体(T -∆cp)导致比野生型TBSV表型轻微(Scholthof et al . 1993年)。接种转基因植物最初发展了轻微的T -∆cp症状并没有明显的病毒微粒。然而，在2个wpi中，容易识别的野生型致死综合症开始在转化株个别植物中零星出现，这些植物中含有大量的病毒微粒。不同的检测方法，包括免疫印迹,RNA杂交分析，以及从病毒微粒中分离出RNA的RT-PCR产物的测序，都表明，具有功能性外壳蛋白的病毒粒子是由同源重组与外壳蛋白转基因重新组合再生的。对照实验中含有识别限制酶多态性的TBSV外壳蛋白突变体，以及含有46 -nt TBSV外壳蛋白缺失的CNV嵌合体，为修复外壳蛋白基因提供了额外的证据。从这些实验中，我们得出结论，在个体植物感染过程中，涉及到转基因植株中外壳蛋白mRNA的表达和外壳蛋白缺陷基因组的双重组事件是常见的。随着TBSV系统的出现，与恢复野生型TBSV和CNV嵌合体相结合的致死综合征的出现，提供了一种易于识别的表型标记来鉴定重组体。
多种生物因素可能会影响野生型病毒的产生
在我们的研究中，有几个因素可能导致了大量的重组。一个主要的因素是，番茄丛矮病毒通常看起来缺乏高水平的转录保真度。番茄丛矮病毒感染的一个特点是经常出现通过重组产生的不良干扰RNA。
另一个可能影响其重组水平的重要因素是，TBSV涂层蛋白的突变体能够系统地传播。因此，在接种了番茄丛矮病毒突变体的植物中，大量的细胞最终支持病毒的复制。当重组的事件发生在转移范围的感染时，野生型重组迅速控制感染并引发致命综合症。与此形成对照的是，感染CCMV突变病毒的感染病灶被限制在最初感染的细胞中，直到出现了运动能力的重组体。因此，大量复制的TBSV RNAs，再加上大量感染的细胞发展为全身性感染，可能导致在单个接种的植物中再生野生型病毒的可能性相对较高。
促进功能性TBSV外壳蛋白再生的第三个因素是转基因与突变的外壳蛋白基因之间存在大量同源性。我们对CAT衍生物的分析表明，共同序列的比例影响重组后的恢复，这可能直接关系到被感染细胞中允许的重组频率的增加。在T-CAT中，外壳蛋白基因比T -∆cp包含了更实质性的缺失(655 nt;56%),在转基因RNA和变异病毒外壳蛋白基因之间的同源性区域的长度似乎影响重组体的发生频率。在接种的植物中，只有不到4%患上了致命的综合症，相比之下，同一株系的植物接种了更小的疫苗(46 nt;大约4%)T -∆cp缺失，约为15%。在这两种情况下，接种的植物再生野生型TBSV的比例略高于Greene和allison观察(1994)的比例，其中3%的转基因植物接种了CCMV外壳蛋白缺失突变体再生野生型病毒。然而，由于TBSV和CCMV的实验系统之间存在大量的差异，很难直接比较重组的恢复
在我们的研究中，毫无疑问地抑制了野生型病毒的恢复，其中一个因素是，表达的TBSV转基因RNA需要在TBSV和外壳蛋白转基因之间进行双重重组。因此,大量的因素,包括聚合酶错误频率,重组事件的本质,病毒突变体的表型,突变体建立系统性感染的能力,和选择压力的迫切需要重组的出现,都是重要的因素,可能影响进化的重组病毒衍生物

花椰菜花叶病毒35S、肌动蛋白、泛素促进剂对转基因剑兰植物的UIDA表达的影响
EFFECT OF THE CAULIFLOWER MOSAIC VIRUS 35S, ACTIN, AND UBIQUITIN PROMOTERS ON UIDA EXPRESSION FROM A BAR-UIDA FUSION GENE IN TRANSGENIC GLADIOLUS PLANTS
摘要
组织模式和水平的基因表达特征在转基因剑兰植物含有草丁膦乙酰转移酶(bar)-β-葡萄糖醛酸酶(uidA)融合基因启动子的转录控制的花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S),重复的CaMV 35S(2 CaMV 35S),水稻肌动蛋白(Act1),或者拟南芥泛素(UBQ3)启动子。该bar基因对草丁膦(PPT)具有抗性，含除草剂并允许对转基因细胞进行选择。由大肠杆菌uidA基因位点编码的β - 葡萄糖醛酸酶基因作为一名报告基因。融合了bar-uidA基因的转基因植物，分别在CaMV 35S、重复CaMV 35S、UBQ3和Act1启动子的控制下，叶片中β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的最大含量为173、112、50和10 nmol 4 -甲基伞形酮的h^-1 mg^-1蛋白。在单株植物叶片间的GUS活性变化频繁，各启动子独立转化植株间的uidA表达水平各不相同。从转基因植株中获得的愈伤组织在GUS表达中的变化比树叶少得多。相对于UBQ3启动子，转基因愈伤组织株系包含CaMV 35S的GUS活性平均水平明显升高(超过3) ,而且这确认了相对于UBQ3启动子，CaMV 35S启动子的植物叶片高GUS活动水平(2)。用组织化学染色法测定uidA表达的组织特异性模式。来自植物的树叶5 - 6厘米长，所测试的四个启动子中的任何一个都显示了，uidA的表达主要于脉管系统。在所有四个启动子中，uidA在根尖上的表达比叶子更频繁。
关键词:GUS;单子叶植物的鳞茎;剑兰;转化;转基因。
介绍
如果基因工程应用于商业目的，那么转基因表达的调控是至关重要的。必须在特定的植物组织中表达一种利害关系的转基因生物，并达到其预期目的的水平。对单子叶植物基因表达的调控主要涉及对玉米、水稻等农业重要谷类作物的研究。组织特异性或发育基因表达的相似性发生在许多转基因谷物中。由一个特效的启动子启示，启动子对基因表达的控制与谷类相似(Shimamoto,1995)。
瞬态的uidA基因表达研究(Schledzewski和Mendel,1994;Wilmink，1995)已经表明，大多数的单子叶谷物都具有明显较高水平的GUS活性，与单子叶植物来源的启动子，如Act1(水稻肌动蛋白)基因(McElroy et al .，1991;Zhang et al .，1991)或Ubi1(玉米泛素)基因(Christensen et al .，1992)，与CaMV 35S(花椰菜花叶病毒)启动子(Odell et al .，1985)比较。相比之下，了一些非谷类的单子叶研究，如黑麦草，百合科的某些成员，以及剑兰，已经发现，非谷类的单子叶植物的Act1和Ubi1启动子相比CaMV 35S启动子具有较低的瞬时uidA表达水平。 (Kamo et al., 1995a; Wilmink et al., 1995)
一些非谷类叶植物在基因表达调控上的明显差异只在瞬态表达系统中得到研究。在这项研究中，转基因植物剑兰被开发出来描述组织特异性模式和无论是双子叶植物或谷物启动子在非谷类单子叶植物的uidA基因的表达水平。开发转基因剑兰植物的启动子是Act1,CaMV 35S，重复CaMV 35S，和Arabidopsis UBQ3(Norris et al .，1993)与bar - uida融合基因连接。bar-uidA融合基因被选中在这项研究中,是因为预计uidA融合bar基因会稳定uidA转录,导致细胞系数量增加,恢复表达uidA,而且融合基因的uidA表达式将持续更长一段时间的相比共同转化uidA表达的。其他(Spencer et al .,1992;Register et al .，1994)报告了时间损失uidA表达，希望在本研究中可以避免这一点。
结果
转基因剑兰植物的恢复。数量最多(109)公认的转化植物恢复自40盘悬浮细胞，它被pDM327或psan18轰击，它分别包含在CaMV 35S或重复CaMV 35S启动子下bar-uidA的任何一个。相比之下，23个公认的转化植株从21盘在Act1启动子下bar-uidA轰炸恢复，并从21盘被含有UBQ3启动子的psan152轰炸恢复了27个植株。随着它们的再生，超过90%公认的转化植物含有任何一个CaMV 35S,Act1，或UBQ3启动子显示uidA表达6 mo。只有43%公认的转基因植物与uidA在Ubi3或Ubi7任一启动子共转化，显示uidA表达。所有转基因植物最初都是基于PPT抗性选择的，而那些显示uidA表达的植物也被进一步分析
DNA凝胶印迹分析验证了剑兰植物基因组DNA中存在的各种质粒DNA(图2)。预计2.5 kb bar-uidA融合基因观察到转基因植物在任一CaMV 35S,Act1下含有的uidA(图2,车道5和7),重复CaMV 35S或UBQ3启动子(图2 B,车道分别5和7,)。预计5.7 kb条带(根据psan18质粒DNA的消化大小)SmaI消化后没有看到植物基因组DNA包含的重复CaMV 35 s启动子(图2 B,车道6),尽管这个条带,还有一个代表重排的3.0 kb条带,被看到长曝光后的放射自显影(数据没有显示)。
图2

GUS的表达水平。在含有CaMV 35S启动子的独立转化剑兰与玉米之间的报告中，uidA表达有很大的差异。6个单独叶片的GUS表达水平变化了12.3倍，尽管叶子从单一起源，无性系剑兰植株含有CaMV 35S启动子，而且这些植物都是在一个品红瓶中离体生长出来的。在转基因剑兰植物树叶之间的GUS表达变化大和少数植物分析结果发生植物含有四个启动子之间在统计学上没有显著的差异(表1)。四种启动子对GUS表达水平的数据主要表明,包含CaMV 35S启动子的植物将有能力来表达一个更高水平的GUS(173 nmol 4-MU h^-1 mg^-1蛋白质)比植物随着Act1或UBQ3任一启动子的更频繁(图3 C–F)。GUS活性达到最高水平由五种转基因植物中的一个含有Act1启动子，为10 nmol 4- MU h^-1 mg^-1蛋白，而包含UBQ3启动子的五种植物中，有一种最高水平为50 nmol 4- MU h^-1 mg^-1蛋白(图3 D,F)。

图3
转基因植物愈伤组织的GUS活性变化比来自同一植物叶子的GUS少;然而，愈伤组织的水平远高于叶片中发现的水平(图3 A,B)。愈伤组织来自包含CaMV 35S启动子的植物株系变化是2.6倍，其叶片中发现有12.3倍的变化。来自包含单一CaMV 35S -植株的愈伤组织的GUS表达水平提高33倍(2,287±288 nmol 4-MU h^-1 mg^-1)比来自同一植物的叶子水平(70 ± 19)。来源于转基因植物的愈伤组织含有CaMV 35S或UBQ3启动子任一显示,转基因株系包含CaMV 35S的GUS活性的平均水平相比之下明显高于(3)UBQ3启动子(表2),这证实了高(2)GUS活性水平在CaMV 35S启动子的植物叶片里(表1)。
表2

CaMV 35S和重复CaMV 35S。在CaMV 35S启动子下，有大量的植物(3 / 8)表达GUS的活性超过10 nmol 4- MU h^-1 mg^-1蛋白相比植物(1/4)中含有重复CaMV 35S启动子(图3 C,E)。
通过Southern杂交分析了含有CaMV 35S启动子的5个转基因植物，拷贝数或bar - uidA基因重排与GUS表达水平之间没有明显的相关性(图2 C,D)，不能确定准确的拷贝数，因为剑兰的基因组大小未知。来自三个转基因植物的叶片表达了173,21和1 nmol 4-MU h^-1 mg^-1蛋白质，每个包含一个完整的bar-uidA基因拷贝类似的条带强度(图2 C,车道4和5和图2 D,车道5)。来自两个独立转化植物的叶子都表现出非常低水平的GUS,1 nmol 4-MU h^-1 mg^-1蛋白质,包含一个完整的拷贝或多个拷贝包括三份重排的bar-uidA拷贝(图2 D,车道4和5)。
含有CaMV 35S启动子的转基因植物最初是通过愈伤组织的组织化学染色来确定其再生小芽芽(图4 A)，再生的愈伤组织着色不均匀，而且uidA表达最强烈的是在愈伤组织边缘的小型新生芽中。具有GUS活性的强烈阳性反应的转基因植物叶片，在单株植物的叶片间的GUS活性表达频繁表现出变化(图4 B)。有些叶片染上深蓝色，其他的要么是白色的，要么是条纹状的。重要的是核实，在一种植物叶片间的uidA表达的巨大变化不是由于混合的转化和非转化的叶片起源一个基本分生组织中的转化和非转化细胞。转基因植物叶片间表现出变异染色证实了通过对植物生长的MS基础盐培养基添加4 mg 1^-1ppt和Southern杂交方式转化。在4 mg 1^-1 PPT上生长的剑兰植株已经有效地从一个未转化植物和转化的植物混合种群中挑选转化的植物(Kamo et al .，1995b)。
图4
所有的转基因植物在uidA组织特性模式的表达无差异,观察到含有uidA在CaMV 35S或重复CaMV 35S任一启动子下,组织化学染色鉴定所有包含任一启动子的转基因植株显示具有强烈uidA表达在整个根,包括根尖,要么整个叶子包括脉管系统,或只在叶子的脉管系统中(图4 C)。年轻叶子,3-6-mm长芽愈伤组织出现显示比老的叶子表达的变化少(图4 D)。
Act1启动子。检测到GUS活性在低水平，范围从1.0到9.9 nmol 4- MU h^-1 mg^-1蛋白(图3 F)，在所有五个转基因剑兰植物含有uidA在Act1启动子下。
转基因植物含有bar-uidA在Act1启动子下更难再生，相比CaMV 35S和UBQ3启动子,因为细胞在Act1启动子转化下继续增殖为愈伤组织而不是发展成植物时，在再生培养基上培养包含1或3毫克1^-1双丙氨磷。组织化学染色显示uidA在幼叶中表达最强烈，1 - 2厘米长，遍及根部，特别是在根尖(图4 E–G)。老叶，5 - 6厘米长，没有呈现出明显的uidA表达，尽管通过组织化学染色荧光分析检测到低水平的β-葡萄糖醛酸酶活性
泛素启动子。植物的幼嫩愈伤组织在根尖和叶基上染成蓝色(图4 H)。叶子，长5 - 6厘米，从一个含有UBQ3的植物显示出个体叶片间的变异染色反应。有些叶子染得非常蓝，而其他叶子则是淡蓝色。在长有5 - 6厘米长叶片的老植物的根尖上观察到强烈的uidA表达(图4 I)。
在剑兰类植物体外生长的幼叶中，含有Ubi3或Ubi7，从未染过强烈的蓝色，但在局部的脉管系统中显示出微弱的uidA表达，并对最高水平12.0 nmol 4- MU h^-1 mg^-1蛋白的10株转基因植株分析。由Ubi7启动子转化的剑兰再生愈伤组织显示uidA表达。在组织化学染色后，在籽球中没有观察到GUS的活性，最强烈的GUS活性是在根尖上，与Ubi3在快速分裂的细胞中上的GUS表达一致(Garbarino et al .，1992)。一般来说，剑兰植株跟UBQ3、Ubi3和Ubi7启动子转化的叶片的GUS表达水平，随着植物的衰老降低。

讨论
这项研究确定，谷物来源的启动子Act1和双子叶植物相关的启动子CaMV 35S和UBQ3将会在谷物和非谷类单子叶剑兰之间的直接表达组织特异性的表达模式，尽管谷物和非谷类单子叶与这些启动子之间的GUS活性不同。在含有Act1的五种剑兰类植物中GUS的活性水平从未达到最高水平，可以用植物含有两个双子叶植物相关的启动子，CaMV 35S或UBQ3。

功能植物基因组学的一个工具:嵌合RNA / DNA寡核苷酸引起体内基因特异性突变
A tool for functional plant genomics: Chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-specific mutations
摘要 以DNA和修饰的RNA残基组成的自互补嵌合寡核苷酸(COs)作为一种手段(i)建立稳定的,位点特异性碱基替换细胞核中的基因，和(ii)在植物细胞中的细胞核引入移码。为了证明基因家族成员中等位基因特异性突变的产生，COs被设计目标为Pro-196 SuRA密码子，是一种烟草乙酰乳酸合成酶(ALS)基因。一种氨基酸取代在ALS中的Pro-196，赋予除草剂抗性表型，可作为植物细胞的选择标记物。COs被设计成包含一个由25-nt同源结构域组成的一个五脱氧核糖核苷酸的区域(隐藏一个与土著ALS序列不匹配的单一碱基)，两侧区域各自由10个核苷酸组成。在选择性培养基中恢复抗除草剂烟草细胞后，DNA序列分析确定在ALS基因中密码子Pro-196的碱基转换。为了证明单个碱基在靶基因特定位点插入，COs被用于恢复不活跃的绿色荧光蛋白转基因的表达，它被设计成包含一个单一碱基缺失。荧光细胞的恢复证实了缺失校正。我们的研究结果证明了一种技术通过催化碱基替换或碱基添加到特定细胞核基因来修饰单个基因位点的应用;该方法在植物功能基因组学领域具有很大的应用价值。
基因组学是目前植物生物学研究的中心组成部分。拟南芥的基因序列将很快可用，还有许多其他物种正在研究中。识别新基因的速度远远快于其功能的确定。在植物生物学中，一个缺失的技术是有选择性和可靠地创造特异性位点的“基因敲除”或感兴趣同源基因重组或未知功能的能力。基因沉默的现象(例如，反义和共抑制)提供了一种通过创建表达内源性基因沉默的基因序列的转基因作物来理解基因功能的方法。然而，这种方法不适用于多基因家族个体成员的功能基因组学研究，或类似序列的基因，有时在其他技术方面也存在问题。
目前正在探索在原核和真核系统中的一种技术，使用由DNA和2' - O -甲基RNA组成的自互补寡核苷酸嵌合体(COs)，在体内的靶向和突变基因。这些COs被设计成有一个或多个不与内源性基因序列配对的碱基。这种方法成功地用于哺乳动物细胞内特定位点的内源性基因修饰和基因的遗传方式修改。
磺酰脲类除草剂通过阻断乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制支链氨基酸的生物合成，从而抑制植物生长。ALS是由一个双等位基因家族编码的烟草(一种异源四倍体物种)。这些除草剂对含有至少一种改变的形式ALS突变基因编码的植物不再有毒性。
在这篇手稿中，我们的目的是确定COs的引入是否足以引起植物细胞中细胞核基因的靶向突变。为了回答这个问题，COs的设计是为了修改烟草中的ALS基因，以及通过删除绿色荧光蛋白(GFP)基因的单个核苷酸来创建一个灭活的转基因基因。
结果与讨论
在植物细胞中引入嵌合寡核苷酸。在最初的实验中，COs是荧光标记的在最初的实验中，以协助优化，可以通过电穿孔(图2)和微粒轰击来导入植物细胞。通过使用共聚焦紫外显微镜检测到，在植物细胞内的罗丹明标记的COs，并优先定位于细胞核内。在实验协议中提供的详细信息报告了我们对植物细胞的最佳沉淀和基因枪共同导入植物细胞的参数。

因为COs ALS1和ALS2被微粒子轰击引入Nt - 1细胞。在我们的实验设计中也包括以下对照:未被轰击的细胞;一个排除了COs的沉淀的细胞受到金微弹轰击;在没有RNA残基的情况下，细胞以寡核苷酸(ALSD)的DNA序列进行轰击，CO ALS1合成相同（即全DNA寡核苷酸）。而细胞则被非特异性CO(NSC1)轰击。
在CO导入后，对除草剂抗性的假定转换被鉴定为在选择性培养基上积极生长的细胞团(图3)，表1总结了三个独立实验的结果。已经证明，ALS的自发突变可以在培养的烟草细胞中被恢复。而除草剂抗性可能来自于酶中独立的、不同的氨基酸替换。在其他的基因中，除了Pro-196的烟草基因，氨基酸的替代可以对磺酰脲(Glean)和imidizoline(Scepter)除草剂产生抗性，而在196密码子中发生的突变导致了选择性的对Glean的抗性，而不是对Scepter的抗性。为了消除在基因位点上的自发突变，除了Pro-196，候选细胞株中含有3 ppm的
咪唑喹啉酸(阴性选择)(表1)。


通过测量在Scepter上的Glean抵抗细胞的生长，可以进一步确定抗Glean/Scepter敏感的细胞的比例。与未经处理的对照相比，在样本的轰击中，该表型的突变比COs ALS-1或ALS - 2高20倍。这一发现表明，196密码子有选择性的突变。为了获得更确切的证据，因为ALS1和ALS - 2在196密码子中导致了选择性突变率升高，PCR产物放大了这个区域的ALS序列，并对其进行了测序。
重要的是要注意，在烟草基因组中有四个可能的位置，在这个位置上，196密码子可以突变。也就是说，在异源四倍体基因组中，Pro- 196可以在SuRA或SuRB的副本中发生突变。图4显示了Glean /Scepter细胞系中PCR产物DNA序列分析的电泳图。如果一个位点上的个体ALS基因发生突变，而不是其他ALS位点，那么在突变点的PCR产物中会发现一个双峰。这是从196氨基酸(见箭头)的密码子观察到的;我们的结论是，至少有一种ALS的基因被改变了。为了证实这种观察，PCR产物被连接到质粒pGEM-T(容易)，扩增并单独测序。来自对照细胞系的克隆PCR产物在每个实例中都显示出野生型序列，而Glean /Scepter细胞系中产生的克隆PCR产物中，有12 - 67%包含了在编码196氨基酸上的密码子的碱基修饰。从SuRB等位基因中提取的克隆PCR产物没有包含突变，可以解释为COs ALS1和ALS2在SuRA等位基因上有选择性的行为。

有趣的是，在Pro-196的密码子中，修改后的碱基总是被发现是两个COs的不匹配核苷酸中的一个核苷酸。这种异位修饰将Pro -196 CCA转换为Thr -196 ACA(与CO ALS1)或Ser- 196 TCA(CO ALS2)，而不是预计的CAA或CTA。由CO ALS2对ALS的异位修饰有ACA和TCA转换。选择性59 -转移“修复”(或更准确地说，观察到的突变位点)的现象可能表明在这些实验条件下植物细胞的修复酶活性。
烟草nt - 1细胞是一种由4000个巨碱基对基因组成的四倍体，因此，ALS基因(SuRA allele)是一个复杂植物基因组中的目标基因。CO的轰击导致抗除草剂细胞系显示在Pro- 196密码子编码上有核苷酸修饰。我们有两条证据表明，我们恢复的抗除草剂细胞并不是由自发突变引起的。首先，在使用等量的nt - 1细胞进行的实验中，我们已经发现了10 - 20倍的抗除草剂细胞株，它们是用裸金微弹，非特异性的CO，或“只有DNA”的寡核苷酸来进行的。也就是说，ALS COs会使突变频率增加多达20倍。由于突变频率的增加是由于位点特异性的突变，通过对ALS特异性PCR产物的序列分析来验证(图4)，从抗除草剂细胞的DNA中扩增，表明这些细胞中有一个碱基变化，特别是Pro-196密码子。PCR产物随后克隆和测序证实了扩增DNAs的存在，并修饰了一个Pro-196密码子。这些经过改良的细胞系通过持续几个月的除草剂抗性证明了基因型稳定性，并且通过重复的PCR、克隆和测序也可以确定改良的Pro-196的密码子。
我们的细胞团/轰击的数据表明，ALS位点的碱基转换效率比对照组高两个数量级，尽管在实验间，CO转换的效率是可变的。这些结果与最近在其他系统中对CO转换的观察结果类似。效率的变化可能是由于CO的传递或细胞转换能力的变化引起的，这可能随细胞周期变化而变化，或者可能与DNA修复酶的活性有关。
对其他序列目标的进一步研究可能有助于澄清本研究中所观察到的基因修饰的异位性。有趣的是，由ALS2 CO的转换导致了C → T和C →A的变化。进一步研究植物DNA和重组酶修复酶的表征可以更好地理解植物中CO的作用方式。
激活非活性的GFP转基因。GFPs是一种独特的蛋白质类，参与了许多水母的生物发光。在植物中，GFP作为报告广泛应用于瞬态和稳定表达系统的基因表达。利用GFP作为一种模型系统来监测植物细胞内的转化事件，我们生成了一个突变的GFP表达载体含有一个单碱基对缺失的ORF，从而导致了转移突变，从而阻止了蛋白质的翻译。
CO GFP+（旨在恢复GFP功能）是由微粒轰击引入烟草GFP突变体株D6,然后用荧光显微镜观察GFP表型的恢复(图5)。在恢复GFP表型的基础上确定了推定的转换事件。非特异性对照组无GFP表达。在3 - 10天的撞击后观察到GFP的表达。

GFP基因的成功再活化提供了证据，证明COs可以成功地催化我们为其可见的标记表型所选择的细胞核转基因中插入核苷酸。这意味着，这种“核苷酸插入技术”也适用于将一个碱基引入到主动表达的编码序列中，从而使靶基因的移码突变导致无效。
与反义或共抑制策略不同的是，定向基因敲除将在灭活植物多基因家族的特定成员方面具有价值;只要家族成员中的非同源序列可以被确定用于设计一个CO .除了基因沉默之外，这项技术还可以用来改变基因的未翻译或非转录区域。
总结
在这里所展示的实验已经展示了两种不同类型的诱变，这些突变是通过COs在特定位点上催化的，目的是为了设计在细胞核基因组中杂交到一个独特的25-碱基序列。首先，基因中特定密码的突变频率可以提高20倍。我们预计，当控制CO诱变过程的机制具有更好的特征时，这种突变效率将会提高。第二，插入额外的核苷酸可以选择性地改变细胞核基因的编码序列;这是由CO专门为插入碱基的独特的DNA序列而设计的，因为在没有合适的CO的情况下，从未观察到GFP的激活。
现在可以进行进一步的实验来结合上述突变类型。如果两个不同的COs都被传递到植物细胞中，那么很可能会在一个植物细胞中产生一个可选择的突变，而另一个突变会导致一个无关联基因的移码失活。也就是说，可以在已知的功能创建双突变，但第二种可能是为了探索一个独特编码序列失去功能的细胞后果。如果完善，这种方法在功能基因组学上有很大的价值。这种方法也可以使内源植物基因的失活或改变产生更直接的价值，从而改变作物的价值。

聚合酶链反应(PCR)检测Bt玉米热处理产物的基因修饰
Detection of the genetic modification in heat-treated productsof Bt maize by polymerase chain reaction
摘要 本文介绍了一种从抗虫玉米热处理产物中检测转基因抗病产品基因改造的方法，该方法描述了从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中提取的CryIA(b)蛋白的截断版本。通过选择短(211 bp)聚合酶链反应(PCR)扩增的方法，增加了在热处理产物中检测转基因产品的概率。在目标序列中包括与cryIA(b)基因相邻的启动子区域，确保特异性。以玉米作为一种由谷物产品模型展示，在玉米热处理过程中pH值对转基因玉米可检测性的影响。
关键字 聚合酶链反应 转基因玉米 苏云金杆菌 热处理
介绍
在欧洲联盟中，通过基因工程生产的食品的市场配售属于对新食品和新食品配料成分的监管范围。这项立法将食品标签要求ª不再等价º传统食品或食品成分。为了检测重组DNA技术应用所引起的差异，聚合酶链反应(PCR)已被证明是一种选择方法。
转基因作物的主要部分将被作为加工产品来销售(例如，从转基因番茄中得到的番茄酱)。PCR技术在这种加工食品中的基因修饰检测的适用性是由最终产物中DNA的质量决定的。物理和化学参数，如剪切力、热或pH，可能导致基因组DNA的随机分裂。平均DNA片段长度的减少可能导致检测插入的DNA序列不可能。没有对这种影响进行系统的调查;因此，本文的目的是建立一种转基因抗虫玉米(Bt玉米)的热处理产品的数据，表达一种合成基因，该基因编码了从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)衍生出的CryIA(b)蛋白的截断版本。
Bt玉米籽粒已经被证明是容易区分传统育种材料由两个PCR方法:通过扩增合成的cryIA(b)基因整个编码区或通过扩增该基因的内部片段和插入标记基因的序列。本研究的方法是:(1)选择适合于调查玉米加工产品的短但仍高度特异性的PCR目标序列;(2)研究高温度、不同pH值对转基因DNA段的可探测性的影响，用玉米粥作为玉米制品的模型。

结果与讨论
PCR目标序列、引物和探针的选择
以往研究中使用的引物Cry01/02用于检测玉米籽粒中侧翼Cry1A（b）基因合成的基因修饰，从而放大了1914 - bp片段。针对玉米产品的调查，采用了引物cry03 / 04。这对组合的选择是基于以下考虑:
1 .将植物组织暴露在物理和/或化学处理中会导致DNA链上的随机断裂，从而减少平均DNA片段的大小。例如，在热处理猪肉中，已观察到从1100 bp到大约300 bp的转换。对加工过的番茄制品也有类似的效果。根据这些数据，在热处理过程中，保持完好的1914 - bp段的概率似乎相当低。指出了扩增片段的长度在加工食品中成功应用PCR的关键作用。结果，被扩增的目标序列的长度从1914 bp降低到了211 bp。
2。为了保持PCR的特异性，尽管其长度急剧减少，但与Cry1A(b)基因相邻的启动子区域被纳入目标序列。由此产生的扩增子由CDPK启动子的最后73 bp和cryIA(b)基因的n端第一个138个bp组成。这样一种将包括两种不同基因组元素在内的一种特定的基因修饰来扩增区域的策略已经被推荐;例如，检测转基因番茄和大豆。
特异性的检测
用引物Cry03 / 04对Bt玉米进行PCR鉴定，如图2所示。预期的211 bp的扩增产物只出现在转基因样品中(车道 A3)。以玉米特异性的转化酶(ivr1)基因作为一个控制的分离DNA适合PCR。引物ivr1 - f /ivr1- r侧翼区的外显子3号ivr1基因产生226 bp扩增子。该产物在转基因和常规玉米(A2和A4)中可检测到。随后通过探针2进行的Southern杂交研究证实，只有Bt玉米的扩增子含有转基因序列(车道 B3)。

检测极限
为了确定检测方法的极限，从Bt玉米中提取的DNA与非转基因玉米不同数量的DNA稀释。结果如图3所示，利用目前的PCR设置，Bt玉米DNA的比例低至0.01%仍然可以清楚地检测到。在同一范围内(未显示数据)，检测到溴化乙锭染色琼脂糖凝胶和Southern杂交与地高辛标记探针2是在相同的范围。考虑到PCR循环的数量，结果与PCR对转基因大豆和常规大豆的DNA混合物进行PCR调查的结果一致

中性ph值热处理对转基因可探测性的影响
众所周知，暴露在高温下会导致高分子量DNA的碎片化。为了证明所选引物cry03 / 04对加工玉米制品进行基因修饰检测的适宜性，选用玉米粥(煮熟和增稠的玉米粉)作为模型系统。这种经过热处理的玉米产品的例子可以在实验室条件下对加热过程进行相当简单地模拟。周期采样得到的结果如图4所示。

使用短靶序列侧翼的引物cry03 / 04对转基因片段的检测，远比利用引物Cry01/02检测全CryIA(b)基因结果是更加坚定。在煮沸30分钟后，1914 bp的扩增可能不再被检测到，而211 bp碎片即使在105分钟的热处理之后仍然存在。这与提取玉米DNA的分子量分布的相当大范围的扩展一致，而且在煮沸时间为5分钟时观察到的平均数值显著低于1000 bp。(未显示数据)
在酸性和碱性pH值沸腾的影响
许多食物，如水果或蔬菜其特点是酸性ph条件;因此，必须在热处理过程中加速酸催化反应。另一方面，在碱性条件下加工是某些食品生产的一部分;一个典型的例子是在玉米饼和玉米粥的初始阶段使用强碱性溶液。为了确定pH值对转基因可探测性的影响，分别在pH 2和pH 9中进行了制备玉米粥的模型过程。
在酸性环境下玉米DNA的随机分裂大大加快。在pH值2-3 煮沸5分钟后cryIA(b)基因区不再是完整的,因此PCR不能扩增出各自的片段。(图5 A)随后煮沸高达10分钟，通过较短的211 bp片段检测转基因是可能的(图5 B)。

在弱碱性pH值(8.5 - 9.5)中对玉米粥进行热处理，与在中性条件下进行的实验相比，没有造成额外的分解作用。整个cryIA(b)基因区域在暴露60分钟后仍能恢复(图6 A)，在处理105 分钟(图6 B)后，通过引物cry03 / 04仍可获得211 bp片段侧翼。

对酸性和碱性试剂敏感性的差异可以用DNA水解降解机理来解释。在酸性pH值中，嘌呤很容易从核酸骨架中去除出来，这是由于N-糖苷键分裂脱氧核糖残基和这些碱基之间的结合。随后，邻近的39 -59 -磷酸二酯键被水解，导致DNA链可测量缩短。与此相反，DNA在碱性溶液中更难水解。在pH值范围介于8.5和9.5之间，只有双链分离(变性)，但没有骨干的裂解是可以预料的。
加工产品中进行转基因检测的结论
在本研究中得到的结果证实了PCR扩增片段的长度对检测加工产品基因修饰的重要性。通过选择包含两个不同的遗传结构实体的一部分目标区域(如启动子和编码区)，可以确保扩增的选择性。该策略的应用使得在热处理的玉米产品中检测转基因材料成为可能。玉米对酸的暴露降低了检测方法的阳性结果。然而，这一发现应该鼓励开发基于PCR的方法，用于从基因工程生物中获得的其他加工食品。

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续上
将转基因整合到基因组中
杂交结果显示，11株植物中的8株切割DNA的杂交信号如图所示为P44(图4)。确认bar基因整合到基因组中，来自11株PCR阳性植物的基因组DNA用EcoRI消化，质粒(pDM302包含2限制性位点)和用Xbal1(pdm302包含1个酶切位点的质粒)。杂交结果显示，EcoRI在三种植物(P10、P32和P44)中释放了一个片段。P44包含预期大小的一个片段(∼0.9 kb)和两个额外的高分子量条带,表明bar基因在这个株系上标示若干重新排列的副本。(图4)，P10和P32只给出了一个比预期的0.9 kb分子量更低的单一条带(数据未显示)。此外，只有植物P44可以检测出Xbal1片段(对应于bar基因的3 - 4拷贝)(图4)。植物通过PCR筛选uidA基因，或通过组织化学分析uidA基因表达时，在筛选时没有发现共转化的证据。在两个PPT抗性愈伤组织中发现了共转化的唯一证据，未能再生植株，但表达了GUS(图1C)。
bar基因在后代中的传递
T1系种群P10的初步筛选，P32、P44和6个P44的T2种群数量，最初使用PCR，显示P44在T1和T2种群中bar基因的存在，但在P10和P32系的T1种群中并不存在。两个T1中bar基因的分离率，P44 T2种群从3:1没有明显不同，一对杂合基因的孟德尔分离率。六个T2种群的P44检查，一个被证明是均匀的bar基因阳性，表明这个种群来自一个纯合的T1植物(表1)。

从P44 T1子代种群中随机选取了7株PCR阳性植株，以Southern印迹杂交确认bar基因的传播，以及整合位点的数量。杂交结果显示，当基因组DNA经XbaI消化时，所有7株植物的bar基因整合都有相同的模式(图5)，表明这条线的bar基因5份拷贝。利用非放射性检测方法和更小的探针对Southern分析进行了改进，大大减少了对高分子量DNA的非特异性结合，并使T1子代的XbaI片段与植物相比有了更大的分辨率。通过对随机选择的p44 - 2植物进行检测，确定了T2近亲中bar基因的传播。斑点印迹分析表明，所有PCR阳性植株中存在bar基因，PCR阴性植株不存在(图6)，证实了bar基因与T2子代的传递


bar基因在子代的表达
在初始灵敏度试验中,确定测定的最佳PPT浓度,PCR阴性T1植物的叶段P44显示没有明显的耐受3 mg 1^−1 PPT ，而在培养基中PCR阳性植物能够容忍高达10 mg 1^−1 PPT(图1 G)。5 mg 1^−1 PPT随后用于对后代的PAT活性筛查。在全部24种PCR阳性T1植物P44的幼叶中检测到高PAT活性，在15个PCR阴性T1植株中未发现显著活性(图1H，表2)，P44-2的T2种群(表2)得到了相似的结果。
为了进一步检验bar基因的表达，测试了T1和T2子代植物对含有PPT除草剂的抗性。在最初的敏感性测试,对照植物显示没有任何抵抗除草剂的浓度稀释挑战(150 g 1^−1 PPT)高于0.2%。因此，这种浓度被用于喷洒从P44的T1和T2 后代随机选择的植物，以及其他假定转基因株系T1 后代的植株。在所有PCR阳性植株中均发现了PPT抗性，但在P44(图1I)T1和T2 后代的PCR阴性植株中，或在其他假定转基因株系(表1)的PCR阴性T1植物中均未发现。
讨论
在谷物和草类的转化中，悬浮培养通常被用作原生质体转化的来源，或作为微炮弹轰击的直接目标组织。然而，在本研究中，由于细胞胞外多糖的过度生产而导致燕麦悬浮培养物的快速生长的是不可能的，这一现象之前曾在燕麦中报道过(Conrad et al .，1982)。此外，与其他谷物的报告相反，燕麦未成熟的胚胎可能不适合通过微丸轰击直接转化的目标组织，愈伤组织诱导，因为在大多数燕麦品种(Kuai和Perret，未发表的结果)中，胚胎性愈伤组织只能在低频率诱导。
从未成熟的胚胎引起的原胚性愈伤组织，另一方面显示出uidA基因的短暂表达频率较高，且再生能力最高达20周。在此之前，有报道称，利用胚胎基因calli生产转基因燕麦(Somers 等人，1992)，以及转基因水稻(Li等人.，1993)，玉米(Walters等人.，1992)，小麦(Vasil等人 .，1992;周等人 .,1993;奈拉等人，1994年)，大麦(Wan等人.，1994)和剪股颖属沼生苦苣菜(钟等人，1993)。
正如之前在不同的春季燕麦品种中发现的(Somers等人.，1992,Gless等人.，1998)，bar基因赋予的PPT抗性被证明是一个有效的可选择的标记，可以在Melys燕麦中稳定的恢复。在合同中，虽然已经恢复了潮霉素抗性菌落，但没有证实含有hpt或uidA基因，没有植株再生，这表明了潮霉素可能抑制了燕麦中体细胞胚胎发生。Torbert等人.(1995)也表明，氨基糖苷类抗生素卡那霉素和G418不适合在燕麦var . Park中进行筛选，但巴龙霉素成功地用于选择nptII基因的表达。
Southern的杂交分析表明，约有5份bar基因拷贝整合到P44基因组中，并有一些拷贝重新排列。3:1的分离比表明，这些基因的多个副本都在一个位点上。这些结果与其他使用直接基因转换方法(Birch，1997年)获得的结果相当。其余的PCR阳性植株要么没有完整的基因拷贝，要么是根据未切割DNA的信号和用EcoRI或Xbal切割的DNA片段进行判断，或者像P10和P32一样，没有将截短的bar基因传递给后代
基于PCR和Southern印迹分析,以及PAT试验和抗除草剂试验,结果表明:bar基因传递和表达在P44的T1和T2后代孟德尔的方式,与其他谷物的报告结果相比较(Christou等人.,1989;Spencer等人 .,1992;Goto等人.,1993;Srivastava等人 .,1996)。在PCR阳性植株P44的T1和T2的后代的幼叶中发现了一种高PAT活性，但在完全展开的叶片中没有发现明显的活性。在所有的子代植物中，均未检测到bar基因表达的失活，表明P44是一个稳定的变异株。

棉花中杀虫基因表达(Cry1Ac)对抗时间-空间变化的一种分子生物学方法
A molecular approach to combat spatio-temporal variationin insecticidal gene (Cry1Ac) expression in cotton
摘要：研究了转基因棉花预先存在转基因系中杀虫基因(Cry1Ac)的时空表达。在田间条件下，不同的棉花株系中，Cry1Ac表达的季节性下降明显不同。研究发现，Bt棉花植株的叶子毒素表达量最高，其次是方形、圆荚、花药和花瓣。随着植株年龄的增加，该基因的表达量不断下降。果腹部分的毒素表达不足以完全抵抗棉铃虫。本季度后期转基因棉株的功效降低是由于启动子活性降低所致。为此,核酮糖-1 ,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)小亚基(rbcS)启动子上游从木本棉分离,进一步克隆的杀虫基因上游(Cry1Ac)表达载体pCAMBIA1301。采用rbcS启动子对当地棉花品种niab - 846进行了改造。用35SCaMV启动子驱动的Cry1Ac基因改造了相同的棉花品种，比较两种不同启动子下杀虫基因的表达模式。结果表明，与35S启动子相比，rbcS是一种有效促进棉株内Cry1Ac基因表达的促进剂。组织特异性启动子的使用也有助于解决生物安全问题。
关键词：rbcS启动子、一致、杀虫基因表达、棉花转换
缩写：CEMB分子生物学卓越中心、rbcS Rubisco小亚基、ELISA
酶联免疫吸附测定、PCR 聚合酶链反应、SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
介绍
棉花是世界上重要的经济和纤维作物，同样也是巴基斯坦经济中的颈静脉，因为它在GDP中占有重要的份额。转基因棉花表达Bt(苏云金芽孢杆菌)毒素目前在许多国家大规模的商业化种植，但数据表明，它在田间和温室条件下对目标昆虫的毒素功效是有差异的(Benedict 等人. 1996;Finnegan等人.1998;Chen等人 . 2000;Guo等人 . 2001;Mahon等人.2002;Olsen等人. 2005;Adamczyk，2009年，Manjunatha等人2009年。Bakhsh等人. 2010年)。对棉花的保护和生产来说，在时间和空间上的差异是至关重要的。
植物组织中内毒素蛋白含量变化的机制相当复杂。在晚期棉花组织中Bt蛋白质含量的研究可以归因于早期Bt基因的过度表达，从而导致转录后水平的基因调控，进而导致后期基因沉默(Xia等人. 2005)。启动子甲基化也可能在内毒素蛋白表达下降中起作用(Xia等人. 2005;Dong 和 Li 2007)。其他因素也可能负责基因表达水平的变化,如基因的核苷酸序列的变化,类型的启动子,和登插入点的DNA插入/盒的转基因品种,转基因拷贝数,内部细胞环境,以及一些环境的外部因素(Hobbset 等人. 1993;Guo等人。2001;Rao 2009)。
世界上几乎所有的转基因作物都利用CaMV 35S启动子(或密切相关病毒的启动子)来驱动转基因(Odell等人. 1985)。只是现在越来越清楚的是，这个启动子并不像实验室和温室研究表明的那样健壮。它的功能受到尚未定义的生理和可能环境因素的影响(Sunilkumar等人.2002;Bakhsh等人 . 2010年)。与时间或空间的具体表达式毒素,组成型表达外源蛋白的转基因植物可能会引起不良反应,如外源基因产物不断合成对植物的代谢负担,而这些可能会增加目标昆虫的Bt抗性的潜在风险。也有担忧转基因植物的食品安全问题(Kuiper等人.2001;Shelton等人 . 2002;Conner等人. 2003年)。
本研究以植物的年龄和以及在不同的植物部分，杀虫基因的表达（Cry1Ac）进行了评价，因为Bt基因的可持续表达对于控制目标害虫的有效性至关重要。设计了一种方法，通过分离出一种从Gossypiumarboreum(cv. FDH-786)中分离出的一种核酮糖-1、5 -二磷酸羧化酶/氧合酶(Rubisco)小亚基酶(Rubisco)启动子，来表达棉花的Cry1Ac的表达。并在Gossypium hirsutum(cv)中进一步转化(cv. NIAB-846)。
结果
Cry1Ac内毒素的时间和空间表达
cry1Ac基因的时空表达进行定量分在转基因后间隔15天。结果表明，植物的毒素水平随植物年龄的变化而下降(图1a)，30天作物在营养期最高。随着作物走向成熟，观察到Cry1Ac基因的表达水平下降。在所有这些转基因株系中也发现了类似的表达模式。统计分析表明，在转基因株系间、采样日期及其相互作用之间的Cry1Ac差异具有显著性5%的意义。
为了对空间表达进行评价，从田间采集叶片、方芽、花柱、花药、花瓣、子房等不同的植株部位，并进行ELISA测定。结果表明，在不同的植物体中，Cry1Ac的表达是可变的，在叶片中最大，其次是方芽、花柱和花药(图1b)。与其他植物体相比，花瓣的毒素表达量较少，而其他植物只有8 - 10 ng/ g，而卵巢的Cry1Ac表达仍无法检测。

叶子生物毒性试验
实验室生物毒性试验与第二龄期棉铃虫幼虫进行实验，以证实在作物年龄30、60和90天的杀虫基因表达变化。结果表明，不同生育期的棉铃虫幼虫在不同生长阶段的死亡率均有差异。不同的死亡率显示了Cry1Ac蛋白水平的变化。转基因株系显示在30天的作物年龄中，有100%棉铃虫幼虫死亡率的，在90天的作物年龄(图2)中，有60 - 80%的死亡率发生变化，而在非转化对照CIM - 482的情况下，没有任何幼虫死亡率的记录。

棉花转换
采用Gould和magallanes - cedeno(1998)的优化方法，对棉花品种进行了改良(图3)，在所有的转换实验中使用了4000个成熟的胚胎。8周后在75 lg/ml潮霉素选择，获得了50株Rb-Ac植物和43株pk2Ac植物植株。在这50株Rb-Ac植物中，有12株植物在田间移动，而10株pk2Ac植物在土壤中适当地生长。两种转基因植物的整体转化效率仍保持0.55%(表1)。


基因整合与表达的确认
通过PCR检测Cry1Ac基因特异性引物，分析了新转化株Rb-Ac和pk2Ac。565 bp扩增片段显示，Cry1Ac基因在Rb-Ac和pk2Ac植物中成功整合，在未转化的植物样本中未观察到扩增(图4a)。所有的转基因植物都是正常的，生长良好。SDS-PAGE证实了Rb-Ac和pk2Ac转基因植物中Cry1Ac蛋白的表达。在所有转基因植物样本中都观察到68 kDa的Cry1Ac蛋白，但在阴性对照(图4b)中没有这种条带，从而证实转基因植株中引入基因(Cry1Ac)的表达。
新转化植物中Cry1Ac的时间和空间表达
Rb-Ac和pk2Ac的转基因植物每隔15天进行ELISA检测，以定量测定杀虫蛋白的Cry1Ac水平。在转基因植物中，Cry1Ac的表达显示，Rb-Ac植物表达了Cry1Ac蛋白的最大表达量，在这些植物中没有表达下降。而在pk2Ac植物的情况下，Cry1Ac水平随着植物的年龄而下降(图4a)。Rb-Ac植物的表达量达到了250 ng/ g的新鲜组织重量，即使植物在90天的时候，对有针对性的害虫进行了充分的保护。
在Rb-Ac和pk2Ac植物的不同植物组织中也对Cry1Ac蛋白进行了量化。植物组织，即叶子、方芽、花柱、花药和花瓣都是为了这个目的而进行的。结果表明，Rb-Ac和pk2Ac两种植物叶片的低温浓度最大，其次是花柱和方芽。与pk2Ac植物相比，Rb-Ac植株花柱和方芽中表现出更多的Cry1Ac表达，而在花药中没有表达(图4b)。

猕猴桃的农杆菌介导转化和再生
Agrobacterium-mediated transformation and regeneration of kiwi fruit
1 Plantech Research Institute, Kamoshida-cho 1000, Midoriku, Yokohama 227, Japan
植物工学研究所，日本，横滨227
2 Present address." Botanical Gardens, Faculty of Science, Osaka City University, Kisaichi 2000, Katano, Osaka 576, Japan
目前地址。植物园，科学学院，大阪城市大学，Kisaichi 2000，大阪576，日本
Received March 7, 1991/Revised version received June 11, 1991 -Communicated by C. Harms
1991年3月7日收到，1991年6月11日收到修订后的版本
摘要
基因改造猕猴桃(Actinidia deliciosa)植物获得自下胚轴和茎段共同培养，与根癌农杆菌菌株EHA101 二元载体，pLAN411或pLAN421，其中包含了新霉素磷酸转移酶II(0ptIl)基因和β - 葡糖苷酸酶(GUS)基因。在与根癌农杆菌共培养后，在含有25 μg /ml 卡那霉素和500 μg /ml 头孢噻肟钠的选择培养基上培养了下胚轴和茎段。在培养一个月后，枝条上的嫩芽再生了。对绿芽进行NPTII活性和GUS活性分析。百分之八十五的绿芽被检查出了nptII和GUS基因。GUS组织化学检测显示，在保护细胞、叶肉细胞和毛细胞中很强的GUS表达。
介绍
猕猴桃(猕猴桃属奇异果)(弗格森1990)起源于中国，20世纪初传入新西兰。猕猴桃的农业生产始于20世纪30年代，因此与许多其他果树相比，它的历史很短。1988年新西兰的猕猴桃产量约为22万吨，在意大利、日本和美国生产的产量较少(国际猕猴桃组织会议1988)。在过去的几年中，产量和种植面积都有了很大的增长，这一趋势预计还会持续一段时间。一般来说，由于软化的原因，很难运输新鲜的水果，而猕猴桃的果实需要在吃之前成熟，让它能长距离运输。因此，对猕猴桃果实的需求预计将在全球范围内增加。
自1937年以来，为改善猕猴桃的努力主要在新西兰进行，大多数现代品种都是从幼苗中挑选出来的。还需要进一步改善这种特性，如甜味、风味、昆虫或疾病的耐受性。
在木本植物中，遗传异质性和较长的生命周期一直是通过杂交育种阻碍基因改良的障碍。因此，通过DNA变换引入农艺的重要特征，为这种改进提供了替代方法。由于大多数木本植物都是无性繁殖的，一旦这些植物引入了理想的特性，就可以通过插枝或嫁接来繁殖，而不需要通过反复回交来修复被引入的基因。
一种农杆菌介导的转化系统已成功地应用在双子叶一年生植物的基因工程(Gasser和Fraley 1989;Horsch等人.1984;McCormick . 1986年)。在木本植物中，已经有相当多的努力建立了许多物种的基因转换系统，如杨树(Parsons等人，1986;Pythoud等人. 1987;菲力特，1987年)，桤木和白桦(Mackay等人. 1988)，柳树(Vahala等人. 1989)，核桃(McGranahan等人.，1988,1990)，苹果(James等人. 1989)，葡萄藤(Barlbault等人. 1989)，火炬松(Sederoff等人. 1986)，花旗松(Dandekar等人. 1987)，和白云杉(Ellis等人.1989)。然而，成功转型的数量仅限于白杨树(Filtatti等人. 1987)，核桃(McGranahan等人.，1988,1990)和苹果(James等人. 1989)。
Fillatti等人.(1987)将aroA和nptII基因导入杂交杨树。McGranahan等人(1988, 1990)利用一种重复的胚胎发生系统和根癌农杆菌共培养获得了核桃转化植株。James等人(1989)与根癌农杆菌共同培养的叶片圆盘重新生成了苹果芽叶。
在本报告中，我们描述了猕猴桃通过农杆菌介导的一种含有nptll和GUS基因的二元载体的成功转化。

结果
植物组织培养
在一星期培养基中与头孢噻肟的培养基中观察到愈伤组织形成。在感染两周后，将这些片段转移到含有25 μg /ml 卡那霉素和500 μg / ml的头孢噻肟的选择培养基上。在下胚轴节段，在选择培养基上两周后观察到芽的再生(图2a)，并在选择培养基上培养三周后在茎段上观察芽。绿芽和白化芽被再生。在某些情况下，两种类型的芽都是从一个片段获得的。这些再生的芽从愈伤组织中被切断，每四到五周就被传代培养到选择培养基上。大多数绿芽继续生长，但有些则变成了淡绿色或棕色(图2b)。白化病的芽没有继续生长，变成褐色。

培养基和外植体的作用
在培养基和外植体组织中均发现了绿芽再生频率的差异(表1,2)。在BSZ培养基上发生的芽诱导比MS4PU培养基快。再生芽的生长速度在BSZ培养基也更快。从下胚轴或培养在BSZ培养基上得到了26 - 62%的再生频率，除了接种了pLAN411的下胚轴段。MS4PU介质的再生频率范围从5.3到17.5%不等。

新长枝的茎段再生率高于幼苗下胚轴。从接种pLAN411的茎段获得的最大再生频率为62%，并在含卡那霉素的BSZ培养基上培养。无菌幼苗叶片段再生频率最低(< 10%;数据未显示)。
我们总共从53个茎段中获得了100多株再生植株，并从21个下胚轴获得70个植株。它们生长在洋红色的盒子里，其中一些被移植到消毒土壤中。
外源基因表达
为了确定在芽形成初期的变化，确定了NPTII酶活性和GUS活性。用斑点印迹法测定了从下胚轴切段获得的13个绿色嫩芽，并对NPTII活性进行了分析。经检查的13个芽中有12个表现出强烈的活性(图3，表3)。


GUS活性测定的13个芽从同一个下胚轴段得到。GUS荧光测定值显示从4.8到8487.7 pmol /min/ mg蛋白(表3)有很大的差异，未感染农杆菌的对照植物的GUS活性较弱，为4.9 pmol /min/ mg蛋白。两种芽，7 - 1和21 - 1，显示了GUS的活性，就像对照植物一样低。我们考虑GUS基因的导入和如果再生芽的GUS基因活性高于10 pmol /min/ mg 蛋白。根据这个标准，13个被检查的芽中有11个含有GUS基因并表达了它(表3)。
从NPTII和GUS活性的综合结果分析，13个芽中11个(- 85%)被证实是转化的(表3)。
GUS表达的组织化学分析
通过荧光测定法证实了GUS阳性芽的定位。以X-葡聚糖为底物，手工切割的叶片和叶柄部分在37℃孵育过夜。在保护细胞、叶肉细胞和叶片的毛状体中发现了蓝色沉淀(图4)。

讨论
这是第一个关于转基因猕猴桃植株的转化和再生的报告。当田间种植的树木茎段与农杆菌共培养时，其转化频率最高。选择培养基中绿色芽的再生频率为62%。约85%的绿芽是经证实转化的。这一频率远远高于此前报道的转基因木本植物，如杨树(Fillattl et al. 1987)和苹果(James et al. 1989)。
尽管在许多木本植物中发现了来自愈伤组织的可怜的植物再生，但猕猴桃的组织培养对于愈伤组织的形成和嫩芽再生都是很容易的(Shimura et al. 1990)。在我们的前期实验中，几乎100%的茎段产生了嫩芽(数据没有显示)。再生频率随培养基的变化而变化，B5培养基中含有玉米蛋白，最适合于获得转化芽(表2)。组织培养中猕猴桃的高反应使其能够以较高的频率获得转化芽。
转基因植物的GUS活性变化从4.8到8487.7 pmol /min/ mg蛋白，如表3所示。GUS活动的差异可能反映了整合到植物基因组或基因组位置的GUS基因拷贝数的差异。虽然GUS基因是由受本构启动子调控，CaMV的35S，已观察到单个植物叶片GUS活性的波动(未显示数据)。它可能是由于生长期、叶龄或继代后产生的不同差异造成的。我们首先检查了再生芽的GUS活性，以确定再生芽是否是一种转化。然而，由于观察到GUS活动的波动，需要进行NPTII活性测定。
虽然转化株编号7-1有阳性NPTII活性，但其GUS活性值为4.9 pmol /min/mg / mg蛋白，其GUS活性值与非转化活性值一样低。可能有两种解释;nptll基因和GUS基因都被整合到猕猴桃基因组中，但只有nptll基因被表达，或者只有nptll基因被整合并表达。这种情况将通过Southern杂交分析法的进一步调查来解决。
这是关于农杆菌介导的猕猴桃转化系统的第一个报告。猕猴桃的基因工程将为传统育种系统提供新的选择。

续上补充：
材料与方法
农杆菌属菌株。用根癌农杆菌菌株EHA101带有一个二元向量pLAN411或pLAN421（图1）。质粒pLAN411含有nptII基因连接CaMV 35S启动子和nopaline胭脂碱合成酶(NOS)终结子。而质粒pLAN421含有nptII基因连接NOS启动子和NOS终结子，在两种质粒中，GUS基因连接35S启动子和NOS终结子。
植物材料制备。种子是从在市场上购买的品种“Hayward”的水果中收集的，在自来水下被洗得很好以去除果皮。然后将其浸泡在2%氯化钠溶液中，用力摇晃25分钟，用消毒水冲洗10次。灭菌的种子被镀在MS(Murashige和Skoog 1962)培养基上，没有植物生长调节剂，用0.8%琼脂凝固。大约一个月后，被延长到3到4厘米的下胚轴被切割成5毫米的线段，感染根癌农杆菌。
茎扦条的制备如下。1989年6月，新伸长的枝条从田间种植的树收集，品种海沃德'Hayward'，种植在名取农场(山梨县)。茎被切至约5厘米长，其表面被中性洗涤剂洗净。插条浸泡在中性洗涤剂溶液中5分钟，用水冲洗5分钟，用70%乙醇浸泡5分钟。他们用1%的低氯酸钠溶液进行了两次10分钟消毒，用消毒过的水冲洗了三到四次。经灭菌后的插条被切成3毫米厚的部分，并被感染根癌农杆菌。
根癌农杆菌感染和嫩芽再生。根癌农杆菌菌株EHA101 / pLAN411和EHA101 / pLAN421生长在5 ml的LB(Sambrook等人1989)培养基中，其中含有50 μg/ ml卡那霉素、25 μg/ ml氯霉素和50 μg/ ml的壮观霉素，在30℃过夜，然后用20 ml无菌蒸馏水稀释。将下胚轴或茎段放入农杆菌悬浮液中，用力摇动20分钟，通过筛网过滤，将其与农杆菌悬浮液分离。
节段被涂在消毒纸巾上，并在不含抗生素的情况下被镀上培养基。对两种培养基进行了检测，其中一种培养基为MS4PU，其中含有1.0 mg/l N-(2 -氯- 4-吡啶基)-N- 苯基脲(4PU)，而另一种培养基B5Z则由B5(Gamborg等人1968)培养基组成，含有3 .0mg/l 玉米素。本研究中用于组织培养的所有介质均以0.2%的凝胶固化。
在与根癌农杆菌共同培养一天后，片段被转移到MS4PU或B5Z培养基上，每一个培养基都添加了500 μg / ml的头孢氨噻肟(头孢噻肟钠，赫司特公司)，以去除细菌。
共培养一周后，片段切割面开始形成愈伤组织。在含头孢噻肟钠培养基的两周培养后，所有的片段被转移到选择培养基，MS4PU或B5Z，辅以25 μg /ml 卡那霉素和500 μg / ml的头孢噻肟钠。在选择培养基上培养两周后，下胚轴段再生嫩芽，培养4周后产生茎段。
再生芽长度达到约5mm时，它们被从愈伤组织或片段切断，转移到新制备的选择培养基。4个或5周后，嫩芽生长到1cm左右，然后转移到另一个由MS培养基组成的培养基中，其中含有25 μg / ml卡那霉素和100 μg/ ml的头孢噻肟钠，没有植物生长调节剂。在新制备的培养基上，每隔4周或5周就会有再生嫩芽，这是一种半强度的MS培养基，有25 μg / ml卡那霉素和100 μg / ml的头孢噻肟钠。在再生芽生根时，将植株移植到无菌蛭石上进行驯化。所有的培养都保持在25℃，16小时在荧光灯下。
NPTII活性分析和GUS分析。根据McDonnel等人.(1987)对NPTII活性进行了斑点杂交分析。根据杰弗逊(1987年)的研究，使用4 -甲基伞状细胞(4 -MUG)的荧光测定法检测了GUS的活性。用5 -溴- 4 -氯- 3- indolylglucuronide(葡萄糖苷酸)组织化学检测(Jefferson 1987)对转化植物中GUS表达定位进行了评价。叶片、叶柄或茎部分切割用剃须刀片进行切割，并与反应物的缓冲液一起孵育(0.1 M磷酸钠缓冲液，pH7.0)含10 mM葡萄糖苷酸在37℃过夜。GUS表达被检测为蓝色沉淀，当叶绿素掩盖观察时，切片被浸泡在70%乙醇的30分钟后，GUS反应脱色的叶绿素，然后在显微镜下观察。